L'identificazione degli stafilococchi coagulasi negativi nella pratica microbiologica: comparazione tra MALDI-TOF e analisi molecolare dei polimorfismi del gene nuc

Gli stafilococchi coagulasi negativi (SCN) sono i batteri pi๠frequentemente isolati nei laboratori di microbiologia clinica; nell'ecosistema cutaneo questi stafilococchi rappresentano microrganismi saprofiti o commensali. In alcune zone del corpo, come narici, ascelle e aree inguinali, possono raggiungere una concentrazione di 103-106 unità  formanti colonia per cm2. Numerosi lavori hanno sottolineato come questi microrganismi possano esercitare un ruolo patogeno nell'ospite con fattori predisponenti; tuttavia, la valutazione del possibile significato clinico del loro isolamento ਠassai difficoltosa: la loro presenza in un prelievo da sede non sterile puಠessere l'espressione di una colonizzazione, mentre l'isolamento da liquidi biologici sterili potrebbe anche essere dovuta a una contaminazione (ad esempio, nel caso delle emocolture). La definizione del possibile ruolo patogeno di uno SCN prevede una corretta interpretazione del dato microbiologico, connessa a un'attenta valutazione clinica. Il laboratorista dovrebbe essere in grado di identificare correttamente, a livello di specie, l'isolato. I metodi convenzionali di identificazione si basano sia sull'osservazione di caratteristiche morfologiche e di crescita, che su prove biochimiche. Attualmente la maggior parte dei laboratori utilizzano nella pratica sistemi identificativi commerciali basati sulla combinazione di reazioni biochimiche, enzimatiche o fermentative. Esempi di metodiche fenotipiche manuali sono l'API 20 Staph® o l'ID 32 Staph® (bioMà©rieux), o le gallerie RapId (Remel, ThermoFisher). Sistemi automatizzati sono essenzialmente il Vitek-2® (bioMà©rieux), il MicroScan® (Beckman-Coulter), il Phoenix® (Becton Dickinson), il Biolog®. Alternativamente, possono essere utilizzate metodiche di spettrometria di massa (“matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry” MALDI-ToF-MS), mentre di pi๠difficile applicazione nella pratica clinica sono le metodiche genotipiche che si basano essenzialmente sull'analisi dei polimorfismi di geni specifici. Indipendentemente dal sistema utilizzato, le tecniche fenotipiche hanno una capacità  identificativa del 70-90%, a seconda delle casistiche; tale percentuale di identificazione si abbassa ulteriormente se dagli studi vengono scorporati i ceppi di S. epidermidis. Inoltre, i sistemi fenotipici non sono in genere in grado di identificare ceppi di riscontro inusuale. Lo studio, oggetto della presente tesi, si propone di valutare le performance del sistema MALDI-ToF Bruker®, utilizzato nella pratica routinaria del Laboratorio di Microbiologia dell'IRCCS Arcispedale Santa Maria Nuova di Reggio Emilia, comparando i risultati ottenuti con quelli di una metodica identificativa molecolare per gli stafilococchi coagulasi negativi. che si basa sui polimorfismi di un gene codificante per una termonucleasi stafilococcica (gene nuc, Hirotaki et al., J. Clin. Microbiol. 2011; 49:3627-31). Sono stati analizzati 188 isolati di SCN appartenenti a dieci specie diverse, per i quali il MALDI-ToF ha dimostrato un'ottima concordanza identificativa, anche se raggiungendo solo occasionalmente la soglia di definizione di specie. Il disegno del lavoro ha quindi previsto la rivitalizzazione di ceppi microbici da Bacterial Storage Medium (terreno agarizzato in microfiale) e da microbeads e loro successiva conservazione; l'estrazione del DNA con metodica del commercio (estrazione tramite colonnine); la reazione di PCR: ordine dei primers, loro risospensione, settaggio della reazione; l'esecuzione di gel elettroforetici; l'analisi dei risultati, valutazione di anomalie e soluzione di problemi.