Progettazione, sintesi e valutazione biologica di nuovi inibitori della Timidilato sintasi che modulano l'interazione proteina-proteina

Il tumore del Colon retto ਠuna delle principali cause di mortalità  in tutto il mondo ed ਠla terza forma di tumore pi๠comune, responsabile di 610.000 decessi ogni anno. Il trattamento si basa principalmente sulla chemioterapia che utilizza come farmaci di prima linea il 5-FU, la Capecitabina e il Pemetrexed, antitumorali che interagiscono con l'enzima Timidilato sintasi (hTS), enzima indispensabile per la sintesi del DNA. Lo sviluppo di resistenza nel tumore del colon-retto ਠassociato all'accumulo di mutazioni genetiche, tra cui una sovra-espressione dell'hTS. L'hTS svolge la sua funzione catalitica in forma dimerica, mentre la sua forma monomerica libera ਠcataliticamente inattiva ed ਠresponsabile dell'azione di autoregolazione ossia dell'espressione dell'enzima stesso. Lo scopo di questo progetto ਠdi indurre una perturbazione nell'equilibrio dimero-monomero a favore della forma monomerica, per inibire l'azione catalitica mantenendo quella regolatoria. Lo scopo della mia tesi di laurea ਠquello di sviluppare degli inibitori dissociativi in grado di perturbare l'equilibrio dimero-monomero. Con questo obiettivo, mi sono occupata della progettazione, sintesi, e valutazione dell'inibizione enzimatica e cellulare di nuovi composti potenzialmente dotati di meccanismo dissociativo. Nella prima parte del mio progetto di tesi attraverso un approccio misto di ligand-based e structure-based, ho provveduto alla progettazione e sintesi di 18 nuovi derivati, analoghi del lead compound (LC1321) ottenuto da studi precedenti, con l'intento di migliore le capacità  dissociative-inibitorie e le caratteristiche farmacologiche. Il meccanismo di inibizione di questi composti ਠstato valutato mediante cinetica enzimatica e l'effetto dissociativo attraverso la metodica FRET. La maggior parte dei composti riporta buoni valori di variazione di FRET in un range che varia tra -0,101 e -0,624 rispetto al valore massimo osservabile in condizioni non dissociative (per il dimero) pari a 1, attestandone la capacità  di destabilizzare la forma dimerica dell'enzima. I composti 1g e 3c presentano valori di IC50 rispettivamente pari a 15 μM e 5 μM e inducono un calo nell'efficienza di FRET rispettivamente pari a -0.624 e a -0.446 a 40μM. La capacità  di 1g e 3c di inibire l'hTS, associata a buoni valori di FRET, supporta un meccanismo di azione per tali composti di tipo dissociativo. Successivamente, nella seconda fase del mio progetto di tesi, ho provveduto a valutare l'attività  di inibizione della crescita delle cellule tumorali dei composti sintetizzati attraverso saggi di citotossicità  cellulare su 3 linee cellulari di tumore colon-retto (CRC), resistenti al 5-FU, e 2 linee cellulari di carcinoma ovarico (OC), resistenti al cisplatino. La maggior parte dei composti induce una morte cellulare pari al 20-30% a 40μM, dipendentemente dalla linea cellulare considerata. In particolar modo, i due composti A21 e C5 mostrano una percentuale di morte cellulare comparabile a quella del composto di riferimento (LC1343), confermando il valore dello scaffold chimico di partenza. Il composto A21 ha un'attività  citotossica pari al 56% sulla linea di OC e al 59% sulla linea di CRC, mentre il composto C5 ha un'attività  pari al 67% sulla linea di CRC e al 52% sulla linea di OC, entrambi alla concentrazione di 40μM. Sulla base dei dati ottenuti ਠstato quindi possibile identificare nuovi promettenti composti, quali agenti terapeutici in grado di agire come inibitori dissociativi della hTS, con la peculiarità  di evitare la sovraespressione della proteina bersaglio. Il mio contributo personale a questo lavoro di tesi ha riguardato la sintesi di 18 composti e la valutazione citotossica cellulare di 32 composti. Questo progetto di tesi si inserisce all'interno del progetto AIRC2015-IG16977 †˜Protein-protein interaction inhibitors of thymidylate synthase against colorectal cancer'.