"IMPLEMENTATION OF AN ION-PAIRING RP-LC/QqQ METHOD FOR THE DETERMINATION OF HIGHLY POLAR ENDOGENOUS METABOLITES AND APPLICATION TO THE STUDY OF THE ADRENOMYELONEUROPATHIC PHENOTYPE OF ADRENOLEUKODYSTROPHY PATIENTS"

La metabolomica ਠuna scienza emergente, con promettenti applicazioni in campo medico e diagnostico. L'approccio metabolomico consiste in una identificazione globale dei componenti di un campione, non supportata da ipotesi a priori, quali quelli presenti in un fluido biologico. Ciಠporta determinazione di un profilo metabolico di un campione in esame. In particolare, la metabolomica consente di determinare i biomarkers responsabili di una determinata patologia e di identificare i metaboliti o pattern di metaboliti utili come discriminanti tra differenti gruppi di studio. Lo studio del profilo metabolomico si avvale di due approcci differenti. L'approccio untargeted prevede l'analisi globale degli analiti misurabili di un campione, senza avere conoscenze pregresse dello stesso. L'approccio targeted, normalmente effettuato in seguito a quello untargeted, permette un'analisi mirata dei metaboliti riconosciuti come potenziali biomarkers, ossia composti biologicamente rilevanti. Lo scopo di questo studio ਠstato quello di potenziare un metodo LC/MS-MS per l'identificazione di pi๠di 200 metaboliti ad alta polarità  in campioni biologici di interesse. A tale fine, sono stati analizzati una serie di campioni standard per determinare le condizioni di detection ottimali degli analiti. Successivamente, l'obiettivo del progetto ਠstato quello di applicare l'analisi metabolomica e la spettrometria di massa alla determinazione dei metaboliti presenti nel plasma di pazienti affetti da una rara malattia congenita, l'adrenoleucodistrofia. Il progetto ha previsto di lavorare con campioni standard e campioni biologici, l'acquisizione dei relativi dati analitici, nonchà© di quelli biochimici, per ottenere dati utili e riconducibili ai diversi fenotipi della malattia oggetto di indagine. L'analisi quantitativa in LC-MS/MS ਠstata migliorata per rilevare 230 composti, in particolare per quantificare metaboliti polari endogeni presenti nel plasma umano, utilizzando una scansione MRM dinamica. Il metodo ਠstato applicato a 29 campioni di plasma, dei quali 15 campioni controllo e 14 campioni di plasma di pazienti affetti dalla malattia. Solo 51 metaboliti hanno prodotto dati quantitativi accettabili, mentre non ਠstato possibile quantificare gli altri metaboliti a causa della bassa intensità  dei segnali. In base ai risultati, pochi metaboliti tra quelli misurati hanno mostrato differenze significative tra i pazienti affetti da AMN e i pazienti sani. La patologia ਠstrettamente correlata al metabolismo degli acidi grassi a lunga catena, e, dai risultati ottenuti, ਠpossibile notare che l'alterazione di questo metabolismo non induce differenze nei metaboliti polari che si possono rilevare nel plasma. Tuttavia, acido piruvico, 2-metil-1-butanolo, creatina and acido 4-piridossico sono emersi come composti significativi nella differenziazione tra i due gruppi, ciಠsignifica che l'effetto dell'alterazione del metabolismo degli acidi grassi a lunga catena puಠestendersi nelle vie metaboliche in cui questi composti sono coinvolti. L'implementazione di questo metodo ha dimostrato che la separazione cromatografica IP-RP fornisce un metodo riproducibile e robusto, che permette la separazione dei metaboliti anionici e polari. Inoltre, la modalità  in MRM dinamico ha permesso una veloce e accurata quantificazione dei metaboliti in LC/MS. Il metodo ottimizzato ha permesso di identificare e quantificare alcuni potenziali differenze tra i pazienti affetti da AMN e i pazienti sani, anche se non ਠstato possibili rilevare tutti i metaboliti.