Attività sulle PKG di un analogo del cGMP in un modello cellulare di degenerazione retinica

Nel mio progetto di tesi siamo andati a caratterizzare molecolarmente l'effetto del composto CN03, un analogo del cGMP ad effetto inibitorio, su un modello cellulare della degenerazione retinica. Il modello cellulare si basava sulla linea 661W di progenitori murinici dei bastoncelli e l'inibizione delle Fosfodiesterasi 6 (Pde6) che causa accumulo di cGMP intracellulare e attivazione delle pathway che vengono innescate nel processo degenerativo del fotorecettore. Lo studio ha permesso di definire la concentrazione ottimale di zaprinast, un inibitore di Pde6b, per indurre una morte cellulare con attivazione di meccanismi molecolari precedentemente caratterizzati in retine con mutazioni in Pde6. Siamo quindi andati a valutare gli effetti protettivi esplicati dall'analogo del cGMP CN03 a contrazioni crescenti e abbiamo definito l'EC50. Avendo il CN03 come target le PKG, ed essendo queste ultime correlate con la patologia, ci siamo chiesti quale fosse effettivamente l'isoforma di PKG che riuscisse ad esplicare l'attività  protettiva o pro-morte. A tal fine abbiamo silenziato l'espressione di PKG1 o PKG2 mediante shRNA nelle cellule 661W, generando cloni stabili. L' EC50 del composto ਠaumentata nei cloni silenziati per la PKG2 mentre ਠinvariata l'EC50 nelle cellule silenziate per la PKG1. Questo risultato suggerisce che il CN03 probabilmente agisce principalmente su PKG2 ma non esclude un contributo di PKG1. Infine abbiamo valutato la possibilità  di generare cellule pi๠affini al fotorecettore in vivo mediante un protocollo di differenziamento delle cellule 661W in cellule simil-bastoncelli. Con il saggio della BrdU abbiamo dimostrato che il differenziamento faceva uscire le cellule dal ciclo cellulare. La valutazione molecolare ha confermato un aumento dei marcatori del fotorecettore supportando la validità  del protocollo di differenziamento sviluppato dal nostro laboratorio e aprendo nuove prospettive all'utilizzo di queste cellule come modello della patologia e per lo screening di nuove terapie biotecnologiche.