Metaboliti untarget di pesticidi nell'uva da vino: sviluppo di una strategia di determinazione analitica

Il presente lavoro di tesi, svolto in collaborazione con il Vassanelli Lab. (VR) ਠbasato sull'analisi di residui di pesticidi nell'uva da vino. In particolare il progetto ਠfocalizzato sulla ricerca dei metaboliti che non rientrano nella definizione del residuo e che quindi normalmente non vengono ricercati. L'analisi di residui derivanti dall'utilizzo di pesticidi all'interno degli alimenti rappresenta un importante settore di ricerca nella chimica analitica moderna. In tale ambito ਠutile conoscere quali sono i prodotti di degradazione che si possono formare dai principi attivi, in modo da poter valutare un eventuale contributo dato dai metaboliti al residuo presente nella matrice analizzata. Il lavoro ha preso in considerazione pesticidi ampiamente utilizzati nella coltivazione dell'uva da vino andando a ricercare i loro metaboliti: in totale sono stati presi in considerazione 23 metaboliti relativi a 19 pesticidi. Il progetto ha richiesto l'utilizzo di pi๠metodiche estrattive: il metodo QuEChERS per gli analiti apolari e il metodo QuPPe per le molecole con carattere polare. Inoltre, nel corso del metabolismo alcune molecole vengono funzionalizzate in modo tale da subire la successiva coniugazione con zuccheri, per questo motivo ਠstato applicato un terzo procedimento estrattivo che prevede l'idrolisi in condizioni basiche del coniugato prima di estrarre l'analita di interesse. I campioni estratti con metodo QuEChERS sono stati sottoposti ad analisi LC-MS/MS in fase inversa (colonna C18) con interfaccia ESI (in modalità  positiva e negativa) e GC-MS/MS. I campioni estratti con metodo QuPPe sono invece stati analizzati in LC-MS/MS con colonna Hypercarb. Il lavoro si ਠsviluppato in pi๠fasi, la prima delle quali ਠstata l'ottimizzazione dei parametri necessari per il riconoscimento degli analiti allo spettrometro di massa. Per le molecole analizzate in LC-MS/MS sono state identificate le transizioni che generano il miglior segnale: quella con maggior intensità  viene utilizzata per la quantifica e un eventuale seconda transizione viene utilizzata per l'identificazione della molecola. Per ogni transizione sono stati ottimizzati i parametri: DP (Declustering Potenzial), CE (Collision Energy) e CXP (Collision Cell exit Potential) necessari per la selezione dello ione che entra nell'analizzatore a triplo quadrupolo, la sua frammentazione, e l'uscita dei frammenti verso il detector. Attraverso la preparazione di un mix contenente gli standard delle molecole target sono stati verificati i tempi di ritenzione dei singoli analiti, parametro indispensabile per il corretto riconoscimento della molecola. Per l'analisi in GC-MS/MS ਠstato svolto un'ottimizzazione come per la parte di LC-MS/MS con la differenza che l'unico parametro da ottimizzare ਠstato CE (Collision Energy). Sono stati quindi creati i metodi per l'analisi inserendo per ogni molecola i parametri necessari al suo riconoscimento. Mediante lo spike a 10ppb, 100ppb e 1ppm di un campione di uva da vino risultato privo di molecole di pesticidi nelle precedenti analisi ਠstata costruita la retta di calibrazione dello strumento necessaria per la successiva quantificazione degli analiti target. àˆ stata verificata la regressione lineare r>0.995 per tutti gli analiti analizzati e per ognuna delle molecole ਠstato inoltre calcolato il limite di quantificazione (LOQ). L'analisi di campioni drogati con le molecole target ha dimostrato la capacità  dei metodi utilizzati di estrarre in modo efficiente i metaboliti oltre alle molecole progenitrici. La determinazione e la quantificazione degli analiti target all'interno dei campioni contenenti i pesticidi progenitori ha permesso di concludere lo studio con una valutazione della correlazione tra la concentrazione dei metaboliti rispetto alla concentrazione dei principi attivi di partenza.