Isolamento e caratterizzazione biochimica del citocromo c2 di Neisseria gonorrhoeae - un possibile elettron donatore per la perossidasi batterica

Neisseria gonorrhoeae ਠun patogeno umano obbligato che causa la gonorrea, una malattia trasmessa sessualmente, che infetta ogni anno milioni di persone in tutto il mondo. Durante l'infezione, al fine di far fronte allo stress ossidativo dovuto al perossido di idrogeno (H2O2), una delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) generata dai meccanismi di difesa dell'ospite, N. gonorrhoeae utilizza il citocromo c perossidasi (NgCCP), una lipoproteina della membrana esterna, che catalizza la riduzione del perossido di idrogeno in acqua. La forma solubile di questo enzima e il putativo donatore di elettroni, il citocromo c2 di N. gonorrhoeae, sono stati eterologamente espressi in E. coli BL21(DE3) e isolati dal suo periplasma attraverso diversi protocolli cromatografici di purificazione. Il citocromo c perossidasi di N. gonorrhoeae ਠstato purificato utilizzando una cromatografia di affinità  seguita da una cromatografia di filtrazione gel. Dal momento che questo piccolo citocromo non era mai stato nà© isolato nà© biochimicamente caratterizzato prima, questa tesi ਠfocalizzata sul citocromo c2. La procedura di isolamento del citocromo c2 ਠstata eseguita attraverso due diversi protocolli, ossia erano una cromatografia di affinità  seguita da una cromatografia di scambio cationico come prima procedura di purificazione, e una cromatografia di scambio cationico seguita da una cromatografia di esclusione molecolare come seconda procedura di purificazione. Il metodo Lowry e il metodo pyridine-hemocromogen sono stati utilizzati rispettivamente per la quantificazione della proteina e dell'eme per determinare il rapporto eme/proteina pari a 0,6. Diverse tecniche spettroscopiche sono state utilizzate per la caratterizzazione biochimica del citocromo c2. In particolare, lo stato di ossidazione della proteina ਠstato esaminato dal suo spettro di assorbimento UV-visibile e la resa del citocromo c2 di N. gonorrhoeae purificato ਠstata calcolata misurando l'assorbimento nello stato come isolato a 410.5 nm della banda Soret, con ï�¥410.5 nm = 116 mM-1cm-1 come coefficiente di estinzione molare. La prima procedura di purificazione ha avuto un rendimento pari a 1,63 mg/mL, mentre la seconda aveva un rendimento di 1,05 mg/mL e tali procedure di isolamento sono state esaminate mediante analisi comparativa. Lo spettro 1H-NMR ha permesso di valutare il folding della proteina e la sfera di coordinamento. La risonanza a -3,39 ppm ਠstata attribuita al metile di un residuo di metionina. La tecnica del dicroismo circolare ha permesso di stimare la struttura secondaria, l'interazione matrice-eme della proteina e alcuni parametri termodinamici, come l'entalpia di denaturazione (H) risultante pari a 156,7 kJ/mol e la temperatura di denaturazione (TM) pari a 60,6 °C del citocromo c2. I dati risultanti erano coerenti con lo spettro di assorbimento nell'UV-visibile e con l'analisi dell'allineamento delle sequenze omologhe, che hanno identificato la metionina in posizione 71 (Met71) come conservata e, quindi, poteva essere proposta come ligando assiale del ferro dell'eme. Uno studio di cinetica sul citocromo c2 di N. gonorrhoeae in presenza del citocromo c perossidasi ਠstato eseguito perossidasi monitorando l'ossidazione del citocromo c2 ed ha rivelato l'attività  perossidasica, come ci si aspettava. Tuttavia, la procedura del saggio performato richiede un'ulteriore ottimizzazione perchà© il citocromo c2 risultava comunque ossidato durante il test, probabilmente a causa di una seppur minima quantità  di ossigeno molecolare (O2). D'altro canto, ਠstato possibile osservare una piccola ri-ossidazione del citocromo all'aggiunta di NgCCP, indicando che il citocromo c2 potrebbe essere un possibile elettron-donatore di questo enzima.