Studio fluorimetrico di nuovi inibitori dissociativi di timidilato sintasi umana

La timidilato sintasi umana (TS) catalizza la sola via di biosintesi della desossitimidina monofosfato, uno dei mattoni del DNA. Essa svolge quindi un ruolo chiave nella proliferazione delle cellule tumorali e suoi inibitori sono entrati in protocolli clinici per il trattamento di diversi tipi di tumore (es., il carcinoma del colon-retto, il mesentelioma, il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSLC)). Tuttavia tali chemioterapici, ad es. il 5-fluorouracile o il methotreaxate, che legano TS nel sito catalitico, inducono spesso sviluppo di resistenza ai farmaci antitumorali. Di qui la necessità  di nuove strategie terapeutiche basate anche su inibitori di TS con meccanismi d'azione diversi. Una di tali nuove strategie si fonda su inibitori allosterici di TS che agiscono destabilizzando la forma dimerica della proteina, l'unica cataliticamente attiva, a favore dei due monomeri inattivi. Nella prima parte del mio lavoro di tesi ho purificato la timidilato sintasi attraverso culture di batterio E.Coli BL21 trasformati in precedenza con un plasmide pQE80L. Ho poi proceduto a coniugare la proteina con due sonde fluorescenti che danno trasferimento di risonanza di energia d'eccitazione (FRET) quando vicine l'una all'altra nel dimero di TS. In presenza di inibitori dissociativi della proteina dimerica, l'efficienza di FRET, che non puಠavvenire fra sonde legate a monomeri separati, diminuisce. L'ultima parte del lavoro ਠconsistita nella misura di tale efficienza in presenza di potenziali inibitori dissociativi di TS a diverse concentrazioni e nell'analisi dei risultati alla luce di un modello cinetico e termodinamico di inibizione dissociativa.