Sviluppo di nuovi candidati farmaci antiparassitari: studio del profilo ADME-TOX sul target/in vitro di derivati pteridinici

L'organizzazione Mondiale della Sanità  ha inserito diciassette patologie croniche invalidanti nella categoria delle †œmalattie tropicali neglette†� (NTDs), a causa dello scarso interesse da parte delle case farmaceutiche. Tra queste patologie troviamo la Leishmaniosi (Leishmania) e la Tripanosomiasi Africana umana (Trypanosoma brucei). I farmaci in uso per queste patologie sono tossici, costosi e spesso di difficile somministrazione, inoltre, sono vecchi e con il tempo hanno causato problemi di farmaco-resistenza. Questo lavoro di tesi ਠparte di un progetto europeo pi๠ampio, chiamato †œNew Medicines for Trypanosomatidic Infections†� (NMTrypI n° 603240), che si occupa dello sviluppo di molecole efficaci e non tossiche, da utilizzare per le NTDs. I farmaci che hanno come target le proteine del metabolismo dei folati, non mostrano perಠefficacia nei confronti dei tripanosomatidi, in quanto gli inibitori della diidrofolato reduttasi (DHFR) inducono processi di sovraespressione della pteridina reduttasi (PTR1) che permette di bypassare il blocco della DHFR. La DHFR ਠnota da tempo come target dei farmaci antimalarici pi๠noti, tra cui la pirimetamina. Nell'ambito di infezioni come la Leishmaniosi e la Tripanosomiasi, il metabolismo dei folati ha un ruolo importante e in particolare due enzimi che catalizzano reazioni simili: PTR1 e DHFR. L'enzima PTR1 ਠpresente solo nei tripanosomatidi ed ਠcapace di catalizzare quattro reazioni enzimatiche, due delle quali sono le stesse catalizzate dalla DHFR. La ricerca ਠincentrata nell'individuare molecole che inibiscono sia la PTR1, che la DHFR parassitarie (inibitori duali) oppure molecole in grado di inibire in modo selettivo la PTR1, per poi combinarle con un farmaco che va ad agire sulla DHFR. A tal fine, in collaborazione con la Tydock Pharma, ਠstata progettata e sintetizzata una serie di molecole a struttura pteridinica, analoghe del folato che competono con il substrato, in modo da inibire l'enzima e sviluppare azione antiparassitaria. I farmaci verso le infezioni da tripanosomatidi devono avere un profilo chimico-biologico che viene definito Target Product Profile (TPP) specifico per la classe di composti in esame. Lo scopo del mio lavoro di tesi ਠstato quello di selezionare i composti con migliore efficacia inibitoria verso la PTR1, in modo da delineare il migliore profilo enzimatico e determinare la tossicità  verso diverse linee cellulari di mammifero, in quanto ospite del parassita. Inoltre, le diverse linee cellulari sono state trattate con la pirimetamina e il metotrexato. Per raggiungere tale scopo ho svolto le seguenti attività : à¬) purificazione e caratterizzazione delle proteine LmPTR1, TbPTR1, LmDHFR-TS, hTS, hDHFR, espresse in E. coli; à¬à¬) test di screening dei composti sulle proteine purificate; à¬à¬à¬) test di citotossicità  su diverse linee cellulari modello: WRL 68 (linea epatica umana), HepG2 (linea di epatocarcinoma umano), NIH 3T3 (linea di fibroblasti murini), A2780 (linea di tumore ovarico umano). I composti testati hanno mostrato una buona attività  nei confronti della proteina TbPTR1 con una IC50 di circa 1-50 nM e della proteina LmPTR1 con una IC50 di circa 1 µM, rispetto all'inibizione nei confronti delle proteine umane, verso le quali i composti hanno un valore di IC50 circa 10-100 volte superiore. Inoltre, la maggior parte dei composti ha mostrato una minore tossicità  sulle diverse linee cellulari di mammifero, rispetto ai farmaci di riferimento. I composti pteridinici rappresentano un promettente risultato in termini di capacità  di inibizione e selettività  nei confronti delle proteine parassitarie e di una bassa citotossicità . I dati ottenuti, integrati con dati preliminari non ancora pubblicati, sono confrontabili con il Target Product Profile, che permette di selezionare i composti migliori per ulteriori studi di farmacocinetica.