PRECLINICAL EVALUATION OF A NOVEL NFIX INHIBITOR FOR MUSCULAR DYSTROPHIES TREATMENT

Muscular Dystrophies (MDs) are heterogeneous disorders, characterized by progressive skeletal muscle wasting that, in most severe variants, cause wheelchair dependency and premature death due to respiratory failure and cardiac impairments. The best therapeutic avenue for MDs involves corrective approaches such as cell and gene therapy, along with secondary therapies to slow down disease progression and preserve muscle structure. Working in this direction, in 2017 it has been demonstrated that the inhibition of the transcription factor Nuclear Factor 1 X (Nfix) induces histological and functional improvements of the disease by delaying muscle degeneration/regeneration loops, decreasing inflammatory and fibrotic processes, and shifting myofibers towards a more oxidative and damage-resistant phenotype. Moreover, Nfix specific deletion in macrophages delays muscle wasting and the deposition of fibrosis, reinforcing the therapeutic potential. Considering that MEK/ERK pathway induces Nfix expression, Nfix pharmacological inhibition was tested by repurposing FDA-approved MEK- inhibitors. These drugs decreased Nfix protein levels, but the non-specificity of treatment resulted in ectopic calcification, partially reduced by antioxidant supplementation. Hence, the finding of a specific Nfix inhibitor has become the central scope of this PhD project. The 3D structure of the Nfix DNA Binding Domain (Nfix(DBD)) was recently resolved, illustrating a novel MH1-like fold and key features for function, including a Zn²⁺ coordination site, dimeric assembly, and DNA-binding specificity. To find molecules capable to bind Nfix, we screened a library of fluorinated compounds using ¹⁹F-NMR spectroscopy, a method widely used in drug discovery, using Nfix(DBD) as a bait. We identified ARN2011 as a promising molecule and, after confirmation of absence of toxicity, we tested its ability in inhibiting Nfix in several cell types. We evaluated ARN2011 efficacy in muscle stem cell, but also fibroblasts and macrophages extracted from murine, rat and human muscles, in wild-type and dystrophic conditions. We displayed that ARN2011 is capable to inhibit Nfix transcriptional regulation but also its ability to control myoblast fusion and macrophage switch from pro-inflammatory to anti-inflammatory phenotype. For what regards the compound specificity, we exploited RNA-Seq analysis on treated myoblasts, comparing wild-type and Nfix null cells, which suggested few off-target events after treatment. Moreover, these data displayed some new insights into Nfix inhibition on cell proliferation, differentiation, metabolism and signaling. Besides, we also tested ARN2011 on murine and human iPS-derived cardiomyocytes revealing its ability to increase myocytes beating rate, in line with what previously published in Nfix null cardiomyocytes. Moreover, ARN2011 was tested on healthy and dystrophic human iPS-derived neuromuscular organoids, confirming its capacity to inhibit Nfix and ameliorate organoid phenotype in terms of histological and contractile abilities. Furthermore, we assessed ARN2011 action in vivo. The proof of concept was performed by intramuscular injection in dystrophic mice models, focusing on metrics analysis of skeletal muscle morphology, such as deposition of fibrosis, inflammatory infiltrates and cross-sectional area of the myofibers. Results displayed Nfix inhibition, followed by decreased inflammatory infiltrates and fibrotic deposit, along with slowdown in muscle regeneration and a switch towards a slow-twitching and oxidative muscle phenotype. ARN2011 systemic evaluation was then performed both intravenously and intraperitoneally, but the correct posology is still to elucidate, considering that preliminary treatments decreased Nfix expression randomly in different muscles, independently from route of administration and timing of inoculation. Besides, some work was performed to elucidate ARN2011 mechanism of action, by exploiting docking studies and mutagenesis on putative binding residues, but so far, the central amino acid which permit the binding still need to be confirmed. At last, to start ARN2011 drug development, 15 analogues were also tested on murine and human primary myoblasts, displaying several efficacious molecules and guiding the design of our patent for the use of ARN2011 in Muscular Dystrophies treatment. Transcription factor (TFs) targeting was postulated in 2002 by James Darnell as the most direct strategy for therapeutics, however the development of pharmacological ways to hit TFs remains challenging with only few designed small molecules that resulted effective. With this study, we demonstrated the feasibility of pharmacologically targeting a transcription factor in skeletal muscle: this work is the first step towards a specific Nfix pharmacological inhibitor, which would better synergize with corrective therapies, to finally pursue a Muscular Dystrophy treatment.

Le Distrofie Muscolari (DM) sono malattie eterogenee, caratterizzate da progressiva degenerazione muscolare che, nei casi più severi, causa dipendenza dalla sedia a rotelle e morte prematura per blocco respiratorio o disfunzione cardiaca. La migliore strategia terapeutica per le DM coinvolge approcci volti a correggere il difetto genetico, come la terapia cellulare o genica, insieme a terapie secondarie, sviluppate per rallentare il decorso della patologia e preservare la struttura muscolare. In questa prospettiva, nel 2017 è stato dimostrato che l’inibizione del fattore di trascrizione Fattore Nucleare 1 X (Nfix), è in grado di indurre miglioramenti istologici e funzionali in modelli murini di DM, andando a rallentare i cicli di degenerazione/rigenerazione, diminuendo l’infiammazione e la fibrosi e convertendo le miofibre verso un fenotipo più ossidativo e resistente al danno. Inoltre, si è dimostrato che la delezione specifica di Nfix nei macrofagi rallenta la degenerazione muscolare e la formazione di fibrosi, rinforzando il potenziale terapeutico. Considerando che la via di segnalazione MEK/ERK attiva l’espressione di Nfix, recentemente è stata testata l’inibizione farmacologica di Nfix tramite il riposizionamento di inibitori di MEK già approvati dall’FDA per il trattamento oncologico. Questi farmaci hanno diminuito i livelli della proteina di Nfix, ma la non specificità del trattamento ha portato alla comparsa di calcificazioni ectopiche, in parte ridotte dal supplemento nutrizionale con antiossidanti. Per questo, l’identificazione di un inibitore specifico per Nfix è diventata lo scopo centrale di questo progetto di Dottorato. La struttura tridimensionale del dominio di legame al DNA di Nfix (Nfix(DBD)) è stata recentemente risolta, illustrando un nuovo ripiegamento simil-MH1 e caratteristiche centrali per la sua funzione, tra cui un sito di coordinamento per lo Zn2+, assemblamento dimerico e specificità per il legame al DNA. Per identificare molecole capaci di legare Nfix, abbiamo quindi saggiato una libreria di composti fluorurati tramite spettrometria a risonanza magnetica nucleare del fluoro, utilizzando Nfix(DBD) come esca. Tale screening ha identificato ARN2011 come molecola promettente e, dopo la conferma di mancanza di tossicità, abbiamo testato la sua abilità nell’inibire Nfix in diverse tipologie cellulari. Abbiamo valutato l’efficacia di ARN2011 nelle cellule staminali muscolari, ma anche in fibroblasti e macrofagi estratti da muscoli murini, di ratto e umani, in condizioni wild-type e distrofiche. Abbiamo mostrato che ARN2011 è in grado di inibire la regolazione trascrizionale di Nfix ma anche la sua abilità di controllare la fusione dei mioblasti e la conversione dei macrofagi da fenotipo proinfiammatorio a fenotipo antinfiammatorio. Per quanto riguarda la specificità del composto, abbiamo eseguito un’analisi di sequenziamento del RNA estratto da mioblasti wild-type ed Nfix null, trattati e rispettivi controlli, che ha suggerito pochi effetti indesiderati a seguito del trattamento. Inoltre, questi dati hanno fornito nuovi suggerimenti riguardo l’inibizione di Nfix nei mioblasti e il suo ruolo nella proliferazione, nel differenziamento, nel metabolismo e nel segnale cellulare. Parallelamente, abbiamo anche testato ARN2011 in cardiomiociti murini e derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) umane, rivelando l’abilità della molecola di aumentare il battito cardiaco, in linea con quanto dimostrato in un lavoro precedente in cardiomiociti Nfix null. Inoltre, ARN2011 è stato testato su organoidi neuromuscolari derivati da iPS sani e distrofici, confermando la sua capacità di inibire Nfix e migliorare il fenotipo degli organoidi, sia in termini istologici che di abilità contrattili. Abbiamo in seguito saggiato l’azione di ARN2011 in vivo. La prova iniziale è stata eseguita tramite iniezione intramuscolare in modelli murini distrofici, focalizzandoci su analisi metriche e morfologiche, come la deposizione di fibrosi, infiltrati infiammatori e area trasversale delle miofibre. I risultati hanno mostrato l’inibizione di Nfix, seguita da diminuzione di infiammazione e fibrosi, insieme al rallentamento nella rigenerazione muscolare e alla conversione verso un fenotipo lento ed ossidativo. La valutazione dell’azione di ARN2011 tramite somministrazione sistemica è stata poi eseguita sia per via endovenosa che intraperitoneale, ma la corretta posologia rimane ancora da identificare, considerando che i trattamenti preliminari hanno diminuito l’espressione di Nfix in modo randomico in diversi muscoli, indipendentemente dalla via di somministrazione e tempistica di trattamento. In parallelo, lo studio del meccanismo d’azione di ARN2011 è stato eseguito tramite predizioni di legame e mutagenesi sui possibili residui. Le analisi non hanno però confermato l’aminoacido che permette il legame tra il composto e la proteina di Nfix. Infine, per cominciare lo sviluppo farmacologico di ARN2011, 15 analoghi sono stati testati su mioblasti primari murini ed umani, riconoscendo numerose molecole efficaci che hanno permesso la realizzazione del brevetto d’uso per il trattamento delle Distrofie Muscolari. L’inibizione dei fattori di trascrizione (TF) è stata proposta nel 2002 da James Darnell come la strategia terapeutica più diretta. Tuttavia, lo sviluppo di approcci efficaci per contrastare l’attività dei TF si è rivelato complesso, e solo poche piccole molecole hanno mostrato risultati significativi. In questo studio abbiamo dimostrato la possibilità di inibire farmacologicamente un fattore di trascrizione nel muscolo scheletrico: si tratta del primo passo verso lo sviluppo di un inibitore specifico per Nfix, che potrebbe agire in sinergia con terapie correttive già esistenti, aprendo la strada a un trattamento concreto per le Distrofie Muscolari.