Esplorando la biosintesi di metaboliti specializzati antimicrobici in attinomiceti rari

La resistenza agli antibiotici (AMR) riduce l’efficacia degli antibiotici più velocemente di quanto si riesca a sviluppare nuovi farmaci. Questa tesi integra la scoperta genome-guided di antibiotici con l’ingegneria genetica negli attinomiceti, passando dall’identificazione di nuovi scaffold alla chiarificazione della biosintesi e al miglioramento delle produzioni. Il lavoro si concentra su due linee: (i) la scoperta della kineomicina, un nuovo complesso di antibiotici glicopeptidici (GPA) da Actinokineospora auranticolor DSM 44650ᵀ; e (ii) la biosintesi e l’aumento della produzione di GE23077, un inibitore selettivo dell’RNA polimerasi da Actinomadura lepetitiana DSM 109019ᵀ. Il genome mining ha rivelato un cluster genico biosintetico (BGC) atipico in A. auranticolor, e le analisi strutturali hanno confermato come la kineomicina sia una nuova sottoclasse di GPA, con un aglicone inedito. L’ottimizzazione dei processi ha portato a titoli superiori a 1 g/L, rendendo A. auranticolor un naturale overproduttore. Per lo studio di GE23077, il genoma completo ha permesso di identificare il cluster gec, contenente un sistema NRPS non canonico, enzimi per la sintesi dei precursori, trasportatori e il regolatore gecA. Analisi comparative hanno individuato cluster simili in altre quattro specie di Actinomadura, produttrici di GE23077 e nuovi congeneri, incluso un analogo fenil-sostituito. La selezione morfotipica ha raddoppiato le rese di GE23077, mentre l’ingegneria razionale con la sovraespressione di gecA o l’inserimento del fattore di riciclo ribosomiale ha portato a incrementi rispettivamente di 2 e 4 volte. Nel complesso, questo approccio fornisce nuovi scaffold, conoscenze genetiche e maggiore disponibilità, passi chiave verso nuovi antibiotici contro l’AMR.

Antimicrobial resistance (AMR) is reducing antibiotic efficacy faster than new drugs can be developed. This thesis integrates genome-guided discovery of antibiotics with genetic engineering in actinomycetes, moving from scaffold identification to biosynthesis elucidation and strain improvement. Two research lines are presented: (i) discovery of kineomicins, a novel glycopeptide antibiotic (GPA) complex from Actinokineospora auranticolor DSM 44650; and (ii) biosynthesis and production improvement of GE23077, a selective RNA polymerase inhibitor from Actinomadura lepetitiana DSM 109019. Genome mining revealed an atypical GPA biosynthetic gene cluster (BGC) in A. auranticolor, and structural analysis confirmed kineomicins as a new GPA subclass with an unprecedented aglycone. Process optimisation delivered titres above 1 g/L, identifying A. auranticolor as a natural overproducer. For GE23077, a high-quality genome assembly uncovered the gec BGC, encoding a non-canonical NRPS system, tailoring enzymes, transporters, and the regulator gecA. Comparative genomics revealed gec-like clusters in four additional Actinomadura species, which produced GE23077 and new congeners, including a phenyl-substituted analogue. Morphotype selection doubled GE23077 titres, while strain engineering with gecA overexpression or ribosome recycling factor insertion yielded 2- and 4-fold improvements. Overall, this workflow provides novel scaffolds, genetic insights, and enhanced production, advancing antibiotic discovery against AMR.