Biopsia liquida nel carcinoma della vescica in fase precoce: ruolo di test multi-analita su sangue ed altri fluidi biologici

INTRODUZIONE: Il carcinoma vescicale non muscolo-invasivo (NMIBC) rappresenta circa il 75% dei tumori vescicali diagnosticati e sebbene abbia una prognosi iniziale più favorevole, si caratterizza per un alto tasso di recidiva e un rischio di progressione alla forma muscolo-invasiva del 30-50%. Ciò comporta la necessità di una stretta e prolungata sorveglianza, nonché di ripetute terapie intravescicali ed interventi invasivi. Allo scopo di ridurre la frequenza di ripetute cistoscopie invasive, nella gestione clinica del NMIBC permane una rilevante esigenza di biomarcatori non invasivi in grado di stratificare i pazienti in categorie di rischio, migliorare il monitoraggio della malattia, supportare le decisioni terapeutiche ed affinare la prognosi. Un numero crescente di studi scientifici sostiene l’impiego di approcci basati sulla biopsia liquida, che utilizzano biomarcatori circolanti allo scopo di migliorare la precisione diagnostica, supportare decisione terapeutiche più mirate e fornire una prognosi più accurata, riducendo al contempo la necessità di procedure invasive ripetute e il disagio per i pazienti. Sebbene il ruolo della biopsia liquida sia ben consolidato nel contesto metastatico, il suo ruolo nel NMIBC rimane ad oggi poco esplorato. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di valutare l’utilità clinica di una biopsia liquida multi-analita effettuata su diversi fluidi biologici (sangue ed urina) in due coorti indipendenti di pazienti affetti da NMIBC, con l’obiettivo di contribuire allo sviluppo di nuove strategie di stratificazione del rischio e di monitoraggio della malattia. MATERIALI E METODI: Nel seguente studio sono state arruolate due diverse coorti di pazienti con NMIBC: una coorte prospettica (32 pazienti) ed una retrospettiva (93 pazienti). La prima è stata arruolata allo scopo di 1) investigare l’applicabilità della piattaforma Myriapod NGS alla matrice urinaria e 2) verificare la concordanza urina-tessuto per mutazioni clinicamente rilevanti a scopo predittivo. La coorte retrospettiva è stata analizzata allo scopo di rivalutare il valore prognostico delle CTC, alla luce della nuova classificazione delle stesse, e di altri analiti (DP,EV) attraverso l’uso combinato di CellSearch® e di un software (ACCEPT) recentemente integrato nella piattaforma. Per lo studio prospettico, il DNA urinario (utDNA) è stato estratto mediante la piattaforma Maxwell® RSC, mentre per il DNA da tessuto (tDNA) è stato utilizzato kit QIAamp DNA FFPE Tissue. Il sequenziamento di utDNA e tDNA è stato eseguito mediante la piattaforma Myriapod NGS, utilizzando il kit Myriapod NGS Cancer panel DNA, compatibile con iSeq 100, che permette l’analisi di polimorfismo a singolo nucleotide ed indels in 17 geni (ALK, BRAF, EGFR, ERBB2, FGFR3, HRAS, IDH1, IDH2, KIT, KRAS, MET, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, POLE, RET, ROS1) le cui alterazioni hanno rilevanza clinica. Per lo studio retrospettivo, sono state rivalutate, sia manualmente che attraverso l’uso integrato di ACCEPT, immagini archiviate e generate dal sistema CellSearch® ottenute processando 7,5 mL di sangue di pazienti con NMIBC tra il 2010 ed il 2012 (follow-up mediano 65 mesi). Per l’analisi occhiometrica le CTC sono state identificate come eventi con morfologia tondeggiante, con diametro maggiore o uguale a 4 m, positivi per DAPI e CK, negativi per CD45, e con l’area del nucleo più piccola di quella citoplasmatica e inclusa per più del 50% nel citoplasma. Attraverso l’uso di ACCEPT, sono stati definiti i parametri per il rilevamento automatico di CTC, DP ed EV. I dati raccolti sono stati messi in relazione ai seguenti outcome clinici: tempo alla progressione (TTP) e sopravvivenza cancro-specifica (CSS). Per lo studio prospettico sono state condotte analisi descrittive delle variabili categoriali e continue, e i risultati del sequenziamento NGS su tDNA e utDNA sono stati confrontati calcolando sensibilità, specificità, VPP, VPN e concordanza. Le mutazioni comuni ai due test, insieme ai valori di frequenza allelica mutante (MAF), sono state ulteriormente analizzate. Le variabili continue sono state confrontate mediante test U di Mann-Whitney. Per lo studio retrospettivo la correlazione tra CTC, DP ed EV e gli endpoint clinici è stata valutata con curve di Kaplan-Meier e modelli di regressione di Cox univariati e multivariati, includendo età e multifocalità come covariate. Per entrambe le popolazioni, i risultati sono stati espressi come Hazard Ratio (HR) con indice di confidenza 95% (IC95%), e sono state considerate significative le differenze con p < 0,05. Tutte le analisi sono state condotte con R (v.4.4.0). RISULTATI: Nello studio prospettico sono stati arruolati 32 pazienti con NMIBC di età compresa tra 62 e 80 anni, di cui il 68,8% uomini e il 31,2% donne.. L’analisi molecolare mediante NGS ha permesso di delineare i profili mutazionali a partire da tDNA e da utDNA. Le mutazioni più frequenti identificate su tessuto hanno interessato FGFR3, BRAF, KIT ed EGFR, mentre le alterazioni in PIK3CA, KRAS, IDH2 e RET sono risultate meno comuni. L’utDNA, invece, ha mostrato un panorama mutazionale più ampio e complesso, con la comparsa di mutazioni non osservate nel tessuto, come NRAS, HRAS, IDH1, POLE, PDGFRA e ROS1. Complessivamente, le urine hanno rivelato un numero di mutazioni più elevato (102) rispetto ai campioni tissutali (39). La concordanza complessiva tra i due approcci è risultata del 56,3%: in oltre un quarto dei pazienti (28,1%) sono state identificate mutazioni esclusivamente nell’utDNA, confermandone la maggiore sensibilità. Le analisi delle frequenze alleliche hanno evidenziato come le mutazioni nel tDNA presentassero frequenze alleliche più alte, indicativo di cloni dominanti, mentre l’utDNA fosse in grado di intercettare varianti subclonali a bassa frequenza. Dal punto di vista quantitativo, le concentrazioni mediane di DNA sono risultate significativamente più basse nei campioni urinari (1,28 ng/μL) rispetto a quelli tessutali (13,17 ng/μL). Tuttavia, l’indice di frammentazione (IF) ha mostrato una tendenza opposta: l’utDNA era caratterizzato da una frammentazione più bassa rispetto al tDNA, suggerendo una migliore integrità del DNA nelle urine. È stata inoltre osservata un’associazione significativa tra IF urinario e grado della lesione tumorale, con valori più bassi nei tumori ad alto grado. In particolare, la mutazione di FGFR3 si è associata sia al tipo di lesione sia a valori più bassi di frammentazione. Lo studio retrospettivo ha incluso 93 pazienti con NMIBC a rischio alto o molto alto secondo EAU Risk Calculator. La rivalutazione manuale delle CTC con CellSearch® ha identificato 20 pazienti con almeno una CTC (CTC +), i quali mostravano un TTP e una CSS significativamente peggiori rispetto ai CTC− (TTP mediana 18 vs 147 mesi; CSS mediana 70 mesi vs non raggiunta). Inoltre, i pazienti sono stati stratificati in base alla presenza delle CTC in rischio alto (CTC -) e molto alto (CTC +). Confrontando i dati ottenuti con l’EAU Risk Calculator, i due sistemi di stratificazione del rischio sono risultati concordanti nella quasi totalità della popolazione, mentre hanno dato risultati discordanti in 14 pazienti. Dalla correlazione con gli outcome clinici è emerso che il sistema EAU ha sovrastimato il rischio nel 57,14% dei pazienti discordanti e sottostimato il rischio nel 28,6%, mentre le CTC hanno sottostimando il rischio solo nel 14,3%. L’analisi automatizzata con ACCEPT, pur identificando un numero minore di eventi, ha confermato il ruolo prognostico negativo delle CTC e ha inoltre consentito l’identificazione delle cellule DP e delle vescicole extracellulari. La presenza di DP è stata riscontrata associata a un rischio raddoppiato di progressione e mortalità, mentre EV elevate hanno mostrato associazione prognostica negativa solo in analisi univariate. All’analisi multivariata, le CTC sono risultate essere un fattore indipendente più forte sia per la progressione sia per la sopravvivenza (HR = 11), mentre le DP hanno mostrato un impatto significativo ma meno marcato. Le EV non sono invece risultate predittori indipendenti. CONCLUSIONI: Questo studio evidenzia il potenziale di un approccio multi-analita di biopsia liquida, applicato a sangue e urina, come strumento non invasivo per la gestione del NMIBC. L’integrazione di diverse fonti informative, comprendenti DNA tumorale, cellule circolanti, cellule ibride e vescicole extracellulari è in grado di migliorare la predizione del rischio di recidiva/progressione e di orientare le decisioni terapeutiche. In prospettiva, la combinazione tra sequenziamento dell’utDNA e analisi multiparametrica di CTC, DP ed EV nella stessa coorte prospettica di pazienti potrebbe rafforzare l’affidabilità dei biomarcatori e supportare una stratificazione prognostica più accurata.