DETECTION OF SALIVARY BIOMARKERS: QUALI-QUANTITATIVE ANALYSIS OF ENDOGENOUS AND EXOGENOUS COMPOUNDS WITHIN ORAL FLUID AND COMPARISON WITH CONVENTIONAL MATRICES

The rapid development of omics sciences has revolutionized biomedical research by enabling a comprehensive investigation of biological systems through high-throughput technologies. Among these disciplines, metabolomics and lipidomics provide a functional snapshot of cellular processes by analyzing small molecules and lipid species involved in metabolism, thereby bringing the gap between genotype and phenotype. This PhD research employed untargeted metabolomic and lipidomic approaches based on high-resolution liquid chromatography coupled to time of flight mass spectrometry (HPLC-QTOF-MS) to explore the molecular composition of different human biofluids (oral fluid and whole blood) and to identify potential biomarkers associated with physiological and pathological conditions. The main objective of the study was to evaluate how the metabolic and lipidomic profiles are modulated under different physiological and pathological states. Initially, salivary metabolic and lipidomic profiles were characterized in healthy individuals and compared with blood-derived profiles under baseline physiological conditions. This comparative analysis provided insights into the molecular overlap between the two matrices and assessed the potential of saliva as a non-invasive diagnostic alternative to blood. The research was then extended to three applied context: aging, Alzheimer's disease and substance addiction. In the aging study, metabolic and lipidomic signatures were investigated to identify molecules linked to biological aging trajectories and potential longevity markers. Within the AD cohort salivary metabolic and lipidomic alterations were compared between patients and cognitively healthy controls, revealing distinct patterns in glycerophospholipids, sphingolipids, fatty acids and sterol lipids, as well as two metabolites potentially associated with neurodegenerative processes. Finally, in the addiction-focused analyses, the study explored metabolic and lipidomic perturbations related to chronic exposure to psychoactive substances, providing biochemical evidence of systemic dysregulation. Advanced statistical and chemometric analyses, including volcano plots, partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA), variable importance in projection (VIP= score plots and heatmaps were applied to extract biologically relevant information from high dimensional datasets. The integration of bioinformatic platforms such as MS-DIAL and MetaboAnalyst enables robust data processing compound annotation and pathway enrichment analysis. Overall, this study underscores the potential of salivary metabolomics and lipidomics for translational applications in clinical, forensic and physiological research. The findings provide reference data on the metabolic and lipidomic composition of oral fluid, demonstrate its suitability as a diagnostic biofluid and propose molecular candidates that may serve as biomarkers for aging, Alzheimer's disease and drugs addiction. Future studies with larger cohorts and integrated multi-omics approaches will be essential to validate these findings and further advance personalized, non-invasive diagnostic strategies for human health and disease.

Il rapido avanzamento delle scienze omiche ha profondamente trasformato la ricerca biomedica, rendendo possibile un’analisi integrata e sistemica dei processi biologici grazie a tecnologie ad alta produttività. In questo contesto, la metabolomica e la lipidomica rivestono un ruolo chiave poiché offrono una rappresentazione funzionale dello stato cellulare attraverso lo studio di piccole molecole e specie lipidiche coinvolte nei processi metabolici, contribuendo a colmare il divario tra genotipo e fenotipo. Il presente progetto di dottorato ha adottato strategie di metabolomica e lipidomica untargeted basate su cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata a spettrometria di massa a tempo di volo ad alta risoluzione (HPLC-QTOF-MS), con l’obiettivo di caratterizzare la composizione molecolare di diverse matrici biologiche, in particolare saliva e sangue intero e di individuare potenziali biomarcatori associati a condizioni fisiologiche e patologiche. Lo scopo principale dello studio è stato quello di analizzare le variazioni dei profili metabolici e lipidici in risposta a differenti stati fisiologici e patologici. In una prima fase, i profili metabolici e lipidici della saliva di soggetti sani sono stati definiti e messi a confronto con quelli ottenuti dal sangue intero in condizioni fisiologiche basali. Tale confronto ha permesso di evidenziare il grado di sovrapposizione molecolare tra le due matrici biologiche e di valutare il potenziale della saliva come matrice biologica diagnostica non invasiva in alternativa al sangue. Successivamente l’indagine è stata estesa a tre ambiti applicativi di particolare rilevanza: l’invecchiamento, l’Alzheimer e la dipendenza da sostanze stupefacenti. Nel contesto dell’invecchiamento, sono state identificate forme metaboliche e lipidiche associate alle traiettorie dell’invecchiamento biologico e a possibili marcatori di longevità. Nell’ambito dell’Alzheimer, il confronto tra pazienti e controlli cognitivamente sani ha messo in evidenza alterazioni significative nei profili metabolici e lipidici salivari con pattern distintivi di glicerofosfolipidi, sfingolipidi, acidi grassi e lipidi sterolici, oltre all’identificazione di due metaboliti potenzialmente coinvolti nei processi neurodegenerativi. Infine, le analisi focalizzate sulla dipendenza hanno consentito di esplorare le variazioni metaboliche e lipidiche associate all’esposizione cronica a sostanze psicoattive, fornendo evidenze biochimiche di una compromissione dell’omeostasi sistemica. Per l’interpretazione dei dati sono state impiegate metodologie statistiche e chemometriche avanzate, tra cui volcano plot, partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA), variable importance in projection (VIP) score plot e heatmaps, al fine di estrarre informazioni biologicamente significative da dataset ad alta dimensionalità. L’utilizzo integrato di piattaforme bioinformatiche quali MS-DIAL e MetaboAnalyst ha garantito un’elaborazione accurata dei dati, una solida annotazione dei composti e l’analisi statistica dei risultati ottenuti. Nel complesso, i risultati ottenuti evidenziando il notevole potenziale della metabolomica e della lipidomica applicate alla saliva per studi traslazionali in ambito clinico, forense e fisiologico. Questo lavoro fornisce dati di riferimento sulla composizione metabolica e lipidica della saliva, ne conferma l’idoneità come matrice diagnostica e propone candidati molecolari d’interesse come possibili biomarcatori dell’invecchiamento, dell’Alzheimer e della dipendenza da sostanze stupefacenti. Studi futuri su coorti più ampie e basati su approcci multi-omici integrati saranno fondamentali per validare questi risultati e per favorire lo sviluppo di strategie diagnostiche personalizzate e non invasive per la salute umana.