Biomateriali Naturali e Tecniche di Formulazione Avanzate per la Produzione di Nanomedicine

The growing focus on safety, efficacy, and sustainability in healthcare has accelerated interest in natural biomaterials for clinical applications. Natural substances like lipids and proteins often offer biocompatibility and biodegradability, making them optimal materials for drug delivery nanocarriers aimed at improving pharmacokinetics, enabling targeted delivery, and reducing off-target toxicity. However, successful industrial and clinical translation requires not only effective materials but also scalable and sustainable production processes. In response to this need, significant advances have been made to develop innovative fabrication techniques, such as self-assembly methods and microfluidic technologies, that offer precise control over nanocarrier properties, high reproducibility, and compatibility with automation. These approaches also reduce the use of hazardous solvents, simplify production, and facilitate regulatory compliance. By combining natural biomaterials with such advanced fabrication techniques, the field is moving toward clinically viable nanomedicine solutions. In this context, the first section of this thesis presents the development of lactoferrin (LF)-based nanoparticles (NPs) via a heat-induced, solvent-free self-assembly method. Thermal protein denaturation triggered conformational transitions, facilitating NP formation (size ~60 nm, polydispersity index ~0.15, Z-potential +30 mV) with high assembly efficiency (up to 74%). Designed and optimized for gene delivery applications, these NPs efficiently complexed and protected a model small interfering RNA (siRNA), achieving >98% siRNA complexation efficiency at LF:siRNA molar ratios of 10:1 and 20:1. RNase protection assays indicated enhanced siRNA stability at a 10:1 LF:siRNA molar ratio, with a maximum protection efficiency slightly over 60%, whereas naked siRNA was completely degraded. Notably, both frozen and lyophilized LF NPs retained their size, colloidal stability, and siRNA complexation capacity during storage, without the need for cryoprotectants or stabilizers. Ongoing in vitro studies in T98G glioblastoma cells aim to assess NP uptake, intracellular trafficking, and gene silencing efficacy to further validate their therapeutic potential. In the second section, we describe the design and optimization of a novel class of fully cholesterol (Chol)-based NPs for brain-targeted delivery in Huntington’s disease (HD). Starting from a conventional nanoprecipitation method, we produced monocomponent Chol-based NPs exhibiting size ~230 nm, polydispersity index ~0.2, and Z-potential –20 mV. These NPs were functionalized with butyric acid (BUT) as a blood-brain barrier (BBB)-targeting ligand to yield NPs-Chol-BUT. Surface analysis (ToF-SIMS) confirmed ligand presentation, and in vivo studies showed enhanced BBB penetration and accumulation in the cortex and striatum following intravenous administration. TEM imaging revealed NPs within astrocytic end-feet, confirming effective BBB crossing. A glucose-conjugated BUT variant (BUT-Glu) was also explored for BBB crossing but did not show significant advantages over native BUT. To facilitate scalability and industrial translation, we optimized the production process of NPs-Chol-BUT via microfluidics, obtaining NPs with size ~200 nm, polydispersity index <0.15, improved batch-to-batch reproducibility, and storage stability under freeze-drying conditions (with sucrose as cryoprotectant). Ongoing work includes morphological and surface characterization of microfluidic-produced NPs and in vivo efficacy studies in HD models. Future directions aim to expand this platform for dual delivery of Chol and therapeutic nucleic acids (e.g., siRNA), targeting both metabolic and genetic defects of HD.

Il crescente interesse verso la sicurezza, l’efficacia e la sostenibilità in ambito sanitario ha accelerato l’impiego di biomateriali naturali nelle applicazioni cliniche. Sostanze naturali come lipidi e proteine offrono spesso biocompatibilità e biodegradabilità, che le rendono materiali ottimali per lo sviluppo di nanosistemi per la veicolazione ed il direzionamento di farmaci. Tuttavia, per trasferire un prodotto farmaceutico a livello industriale e clinico, sono necessari sia materiali efficaci sia processi produttivi scalabili e sostenibili. In risposta a questa esigenza, sono stati individuati o sviluppati metodi innovativi, come l’autoasseblaggio e la microfluidica, che permettono di avere controllo sulle proprietà dei nanosistemi, elevata riproducibilità e compatibilità con l’automazione. Tali approcci riducono anche l’impiego di solventi tossici, semplificano la produzione e agevolano la conformità da un punto di vista regolatorio. L'utilizzo combinato di biomateriali e tecniche avanzate sta promuovendo lo sviluppo e l’applicazione terapeutica delle nanomedicine. In questo contesto, la prima sezione di questa tesi presenta lo sviluppo di nanoparticelle (NP) autoassemblanti a base di lattoferrina (LF). La denaturazione termica della proteina ha indotto transizioni conformazionali che hanno facilitato l’autoassemblaggio di NP (dimensione ~60 nm, indice di polidispersione ~0,15, potenziale Z +30 mV) con elevata resa (74%). Progettate per applicazione in terapia genica, queste NP hanno mostrato un’elevata capacità di complessare e proteggere un siRNA modello, con un’efficienza di complessazione >98% ai rapporti molari LF:siRNA di 10:1 e 20:1. Test di protezione da RNasi hanno evidenziato una maggiore stabilità del siRNA al rapporto 10:1, con una protezione massima superiore al 60%, mentre il siRNA libero veniva completamente degradato. Tali NP, sia congelate che liofilizzate, hanno mostrato stabilità colloidale e mantenuta capacità di complessazione durante la conservazione in assenza di crioprotettori o stabilizzanti. Studi in vitro in corso su cellule di glioblastoma T98G mirano a valutare uptake cellulare ed efficacia di silenziamento genico per confermare il potenziale terapeutico. Nella seconda sezione viene descritta l’ottimizzazione di una nuova classe di NP interamente a base di colesterolo (Chol) per la veicolazione di Chol al cervello nella malattia di Huntington (HD). Partendo dalla tecnica della nanoprecipitazione, sono state prodotte NP (dimensione ~230 nm, indice di polidispersione ~0,2 e potenziale Z –20 mV) che sono state poi funzionalizzate con acido butirrico (BUT) per l’attraversamento della barriera emato-encefalica (BEE). Analisi di superficie (ToF-SIMS) hanno confermato la presenza del ligando e studi in vivo hanno mostrato un aumento dell’accumulo nel cervello (corteccia e striato) dopo somministrazione endovenosa. Immagini TEM hanno rivelato la presenza delle NP negli astrociti, confermando l’attraversamento della BEE. È stata inoltre testata una variante di BUT coniugata al glucosio (BUT-Glu), che però non ha mostrato vantaggi significativi rispetto al BUT. Per favorire la scalabilità, il processo produttivo delle NP-Chol-BUT è stato ottimizzato tramite microfluidica e sono state ottenute con ottima riproducibilità NP aventi dimensione ~200 nm, indice di polidispersione <0,15 e stabilità alla liofilizzazione (con saccarosio come crioprotettore). Attualmente sono in corso analisi morfologiche e di superficie delle NP ottenute tramite microfluidica e studi di efficacia in vivo in modelli HD. In futuro si prevede l’espansione di questa piattaforma per la veicolazione simultanea di Chol e siRNA con l’obiettivo di colpire sia i difetti metabolici che genetici della HD.