Targeting della risposta al danno del DNA nel carcinoma colorettale mediante la destabilizzazione del dimero della timidilato sintasi umana (hTS).

Thymidylate synthase (hTS) plays a central role in thymidylate biosynthesis, a crucial precursor for DNA synthesis. hTS is consistently overexpressed in cancer and is considered an important target for cancer therapy. Our novel hTS-dimer disruptors, Ddis, inhibit hTS with a different mechanism of action compared to drugs currently used in chemotherapy strategies. Ddis target the hTS dimer-monomer equilibrium, shifting the dimerization equilibrium towards the monomer. Ddis inhibits the activity of this obligate homodimeric enzyme, favours its intracellular degradation and inhibits cancer growth. In the present study, we investigate the effect of Ddis in the HCT116 colon cancer cell line (CRC) and the role of hTS in DNA damage and DNA damage response. Ddis (E7), unlike other drugs currently in clinical use (e.g., 5-Fluorouracil, 5-FU), reduced hTS protein level, induced replication stress and DNA damage (γ-H2AX), followed by G2/M-phase arrest and cell death of CRC cell lines. We demonstrated that hTS inhibitors caused the tumor suppressor P53-binding protein 1 (53BP1) accumulation in the nuclear foci. The 53BP1 plays a pivotal role in orchestrating the DNA Damage Repair (DDR) pathway. Furthermore, after DNA damage occurred following exposure to Ddis, we observed the activation of Checkpoint kinase 1, Chk1 (pChk1-Ser345). Chk1 is an essential kinase required for the G2/M DNA damage checkpoint, which requires ATR serine/threonine kinase. This result was confirmed by the inactivation of nuclear cyclin B/CDK1 activity, which halted mitotic entry and allowed time for DNA damage repair. Next, combination strategies with DDR inhibitors (ATRi and WEE1i), being tested in clinical trials, showed that hTS inhibitors (E7) sensitize HCT116-5FU-resistant colon cancer cells to DDR- signaling blockade. Overall, our results demonstrate a functional link between hTS-dependent cancer metabolism and replication stress that can be exploited therapeutically with this new generation of inhibitors.

La timidilato sintasi umana (hTS) svolge un ruolo centrale nella biosintesi della Timidina, precursore essenziale per la sintesi del DNA. hTS è costantemente sovra espressa nei tumori ed è considerata un importante bersaglio per la terapia antitumorale. I nostri nuovi inibitori dissociativi della hTS (Ddis) agiscono con un meccanismo diverso rispetto ai farmaci attualmente utilizzati nelle strategie chemioterapiche. I Ddis modulano l’equilibrio tra dimero e monomero della hTS, spostando l’equilibrio verso il monomero. I Ddis inibiscono l’attività di questo enzima omodimerico obbligato, favoriscono la sua degradazione intracellulare e bloccano la crescita tumorale. Nel presente studio, abbiamo investigato l’effetto dei Ddis sulla linea cellulare di carcinoma del colon HCT116 (CRC) e il ruolo della hTS nel danno al DNA e nella risposta al danno al DNA (DNA Damage Response, DDR). Il Ddis (E7), a differenza di altri farmaci attualmente in uso clinico (ad esempio 5-Fluorouracile, 5-FU), ha ridotto i livelli proteici di hTS, indotto stress di replicazione e danno al DNA (γ-H2AX), con conseguente arresto del ciclo cellulare in fase G2/M e morte delle cellule CRC. Abbiamo inoltre dimostrato che gli inibitori di hTS causano l’accumulo del fattore soppressore tumorale P53-binding protein 1 (53BP1) nei foci nucleari. 53BP1 svolge un ruolo cruciale nell’orchestrare la via della DDR. In seguito al danno al DNA indotto dall’esposizione ai Ddis, abbiamo osservato l’attivazione della chinasi checkpoint 1, Chk1 (pChk1-Ser345). Chk1 è una chinasi essenziale per il checkpoint G2/M del danno al DNA, che richiede l’attività della chinasi ATR. Questo risultato è stato confermato dall’inattivazione dell’attività nucleare del complesso ciclina B/CDK1, che ha bloccato l’ingresso in mitosi e ha consentito il tempo necessario per la riparazione del DNA. Infine, strategie di combinazione con inibitori della DDR (ATRi e WEE1i), attualmente in sperimentazione clinica, hanno mostrato che gli inibitori di hTS (E7) sensibilizzano le cellule di carcinoma del colon HCT116 resistenti al 5-FU al blocco della segnalazione DDR. Complessivamente, i nostri risultati dimostrano un legame funzionale tra il metabolismo tumorale dipendente da hTS e lo stress di replicazione, che può essere sfruttato terapeuticamente con questa nuova generazione di inibitori.