Ruolo del lncRNA NEAT1 nella regolazione trascrizionale: Meccanismo molecolare e nuovi approcci terapeutici nel mieloma multiplo.

Multiple myeloma (MM) is an incurable hematological neoplasia characterized by abnormal proliferation of clonal bone marrow plasma cells (BMPCs). Despite recent advances in therapeutic options, most patients ultimately relapse and develop resistance to current treatments. Deregulation of non-coding RNAs (ncRNAs) contributes to MM complexity, with aberrant long ncRNAs (lncRNA) expression distinguishing malignant PCs from their normal counterpart. Emerging evidence positions lncRNAs as a key element of genome regulation, driving MM progression and therapy resistance. Among them, the lncRNA NEAT1 has been described as overexpressed in MM patients, promoting malignant PC proliferation. Besides its conventional function in paraspeckles (PSs) assembly, recent findings suggest a direct contribution of NEAT1 in transcription, supporting the idea that it may actively shape the gene expression programs that sustain MM pathogenesis. Here, we described NEAT1 as a therapeutic vulnerability and uncovered its previously unrecognized role in the mitotic transcriptional apparatus, linked to the clinical aggressive behavior of MM. Through integrated transcriptional, computational, and drug-prioritization approaches, we described that NEAT1 targeting sensitizes MM cells to inhibition of AURKA, which regulates spindle dynamics, and CDK9 involved in transcriptional elongation. We demonstrated that AURKA exhibits functional cooperation with NEAT1. To support this, we showed that MM patients with high NEAT1 and AURKA expression experienced a worse clinical outcome. Exploring the bases behind this cooperation, we proved that NEAT1 inhibition exacerbates mitotic spindle defects, conferred by AURKA inhibition. Coherently, we found that NEAT1 inhibition strongly perturbs the mitotic transcriptional program, notably affecting TPX2, the main AURKA allosteric regulator, which emerged as a putative mediator of the NEAT1-AURKA interplay. This evidence, along with the synergy observed between NEAT1 and CDK9 functional inhibition, prompts us to investigate the mechanistic mode of action of NEAT1 in controlling the expression of mitotic genes. By applying computational approaches we identified FOXM1, a key G2/M transcriptional factor (TF) and CDK9 transcriptional kinase, as upstream regulators of the NEAT1 gene expression program. Both FOXM1 and CDK9 participate in the same transcriptional apparatus, named MMB:FOXM1. In line, 60% of NEAT1 target genes harbor a Cell cycle homology region (CHR) motif, recognized by MMB:FOXM1 complex, suggesting that NEAT1 can facilitate the recruitment of this molecular machinery to G2/M gene promoters. Combined RNA-FISH and immunofluorescence revealed the co-localization between NEAT1 and FOXM1 transcriptional condensates, and RIP experiments confirmed direct NEAT1 binding to both FOXM1 and CDK9. ChIP experiments demonstrated a reduced FOXM1 binding to essential G2/M genes upon NEAT1 inhibition, confirming NEAT1 involvement in the mitotic transcriptional machinery. Exploring the clinical relevance of NEAT1 function in gene regulation, we discovered that the NEAT1 program defined two different clusters of patients exhibiting different survival outcomes. Patients with the poorest prognosis showed higher expression of NEAT1’s target G2/M genes, with 20% of them linked to a high risk of progression. Interestingly, these patients presented high-risk chromosomal abnormalities as 1q gain/amp and del17p, suggesting that these genetic subgroups can benefit most from inhibition of NEAT1 and its regulatory circuitry. Overall, these findings demonstrate that NEAT1 coordinates the expression of mitotic genes through FOXM1 and CDK9 interaction, providing a mechanistic rationale for targeted interventions in high-risk patients.

Il mieloma multiplo (MM) è una neoplasia ematologica incurabile delle cellule B, caratterizzata dalla proliferazione anomala di plasmacellule (PC) clonali nel midollo osseo. Nonostante i progressi terapeutici, la maggior parte dei pazienti sviluppa recidiva e farmaco-resistenza. La deregolazione dei trascritti lunghi non codificanti (lncRNAs) contribuisce alla complessità della malattia, distinguendo le PC maligne da quelle normali. Tra questi, NEAT1 risulta overespresso nei pazienti affetti da MM, favorendo la proliferazione delle cellule cancerose. Oltre al ruolo canonico nell’assemblaggio delle paraspecole nucleari, recenti evidenze suggeriscono un coinvolgimento diretto di NEAT1 nella regolazione trascrizionale, indicando un possibile ruolo nella modulazione dei programmi genici implicati nella patogenesi della malattia. In questo lavoro abbiamo identificato NEAT1 come una vulnerabilità terapeutica, rivelandone un ruolo inedito nella definizione di un programma genico, associato a un comportamento clinico aggressivo. Integrando approcci trascrizionali, computazionali e di prioritizzazione farmacologica, abbiamo mostrato che il silenziamento di NEAT1 rende le cellule di MM sensibili all’inibizione farmacologica di AURKA, regolatore della dinamica del fuso mitotico, e di CDK9, chinasi coinvolta nell’elongazione trascrizionale. Abbiamo dimostrato che AURKA coopera funzionalmente con NEAT1. Infatti, i pazienti con elevata espressione di entrambi presentano una prognosi infausta. L’inibizione di NEAT1 comporta un aumento dei difetti mitotici indotti dal blocco di AURKA e altera fortemente il programma trascrizionale che promuove la mitosi, influenzando in modo particolare TPX2, regolatore allosterico di AURKA e possibile mediatore di tale cooperazione. Questa evidenza, insieme alla sinergia osservata inibendo la funzione di NEAT1 e CDK9, ha motivato ulteriori studi sul ruolo di NEAT1 nella regolazione della trascrizione. Abbiamo identificato FOXM1, fattore di trascrizione chiave per i geni della transizione di fase G2/M, e CDK9, come regolatori a monte del programma genico di NEAT1, utilizzando approcci computazionali. Entrambi i fattori partecipano allo stesso apparato trascrizionale, chiamato MMB:FOXM1. Coerentemente, il 60% dei geni target di NEAT1 presentano il motivo CHR sul loro promotore, riconosciuto dal complesso. Questa evidenza suggerisce che NEAT1 possa favorire il reclutamento del complesso trascrizionale sui geni G2/M. Esperimenti di RNA-FISH combinati con immunofluorescenza hanno mostrato la co-localizzazione di NEAT1 con i condensati trascrizionali di FOXM1 ed esperimenti di RIP hanno confermato il legame diretto tra NEAT1-FOXM1 e NEAT1-CDK9. Esperimenti di ChIP hanno dimostrato una riduzione del legame di FOXM1 sui promotori dei geni essenziali della G2/M, a seguito del silenziamento di NEAT1, confermando il coinvolgimento di NEAT1 nell’apparato trascrizionale mitotico. Analizzando la rilevanza clinica del programma genico di NEAT1, abbiamo definito due gruppi distinti di pazienti, con differenti esiti di sopravvivenza. I pazienti con prognosi peggiore mostrano elevata espressione dei geni target di NEAT1 della G2/M e il 20% di questi risulta associato ad un rischio elevato di progressione. Tali pazienti mostrano anomalie citogenetiche ad alto rischio quali il guadagno/amplificazione 1q e delezione di 17p, suggerendo che tali sottogruppi potrebbero trarre particolare beneficio dall’inibizione di NEAT1. Complessivamente, i nostri risultati dimostrano che NEAT1 coordina l’espressione dei geni mitotici attraverso l’interazione con FOXM1 e CDK9, fornendo un razionale per lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate nei pazienti ad alto rischio.