Il ruolo potenziale dell'IL-1β nel determinare l'infiammazione vascolare e i biomarcatori solubili dell'attività della malattia nella vasculite dei grandi vasi

Large vessel vasculitis (LVV) manifests as inflammation of the aorta and its major branches. Giant cell arteritis (GCA) and Takayasu arteritis (TAK) are the two major forms, both characterized by granulomatous inflammation of large arteries. Glucocorticoids are the main therapy, often combined with immunosuppressive drugs. Some biological drugs are available for patients who develop flares despite glucocorticoid therapy or have glucocorticoid-related side effects. Since a fraction of patients show a refractory disease, there is still the need to discover and validate new therapeutic targets. Another clinical need in LVV is the lack of a standardized approach for assessing disease activity. Conventional inflammatory markers do not always reflect vascular inflammation, and identifying disease-specific biomarkers is key to discriminate between active disease and remission. The first project aimed to: i) investigate the expression of IL-1 superfamily members in GCA, and their possible association with patients’ clinical characteristics; ii) evaluate the effects of IL-1β treatment on the transcriptome of primary cultures of temporal arteries (TABs); iii) evaluate the effects of IL-1β inhibition in inflamed TABs cultured in vitro. The second project aimed to: i) identify potential soluble biomarkers for monitoring the disease activity. The influence of matrix types in soluble immune checkpoint detection has also been assessed as a laboratory medicine aim. PROJECT 1. The expression of IL-1 members was evaluated in 38 TABs of GCA patients compared to normal TABs. IL-1β and IL-1RA were present in inflamed TABs but not in normal TABs, while IL-18 was up-regulated in inflamed TABs. The expression levels of these cytokines did not correlate with clinical characteristics, GC treatment at TABs, or therapy response. Transcriptomic changes induced by IL-1β treatment were investigated using RNAseq in a primary culture of TAB, and validated by real-time PCR in different cell models (TAB primary cultures, fibroblasts, monocytes, lymphocytes). IL-1β treatment up-regulated both its own expression and that of several genes (CCL2, CCL20, CSF3, IL-6, IL-8, IL-1RA, FGF-10, TNFα, IFNγ, IL-10, ICAM-1, VCAM-1, and SELE). Then, the effects of IL-1β inhibition were assessed in TABs by treating 11 inflamed TABs with IL-1β inhibitors in vitro, and evaluating the same panel of genes. Canakinumab down-regulated IL-1RA expression in TABs and reduced IL-1β, GROα, and CCL3 levels in supernatants. Overall, IL-1β can promote vascular inflammation and may be a therapeutic target in GCA. PROJECT 2. A panel of 50 cytokines, chemokines, and growth factors was evaluated in serum and plasma from 40 LVV patients. Plasma FGF-2, IL-8, and MIP-1α concentrations significantly decreased, while serum BDNF, MCP-1, and SCF concentrations increased from the active phase to remission. VEGF-A and MIG decreased in both matrices, suggesting their potential use as activity biomarkers. Additionally, 17 soluble immune checkpoints (sICs) were quantified. VISTA levels decreased in plasma, whereas ICOSL levels increased in serum when patients transitioned from the active phase to remission. Finally, to assess matrix effects, the same sICs were analyzed in serum and plasma of 38 healthy donors. Twelve out of 17 sICs showed comparable detection rates between serum and plasma. CD137, CD152, CD40, CD40L, and LAG3 were detected more frequently in plasma, while CD40L was predominant in serum. PDL-2 levels were higher in serum, while CD27 and VISTA levels were higher in plasma. Finally, CD27, CD80, GITRL, ICOSL, TIM3, and LAG3 showed a slight correlation between plasma and serum concentrations. These findings highlight the need for a careful choice of matrix for sICs detection

La vasculite dei grandi vasi (LVV) si manifesta come infiammazione dell’aorta e dei suoi rami principali. L’arterite a cellule giganti (GCA) e l’arterite di Takayasu (TAK) sono le due forme primarie, caratterizzate da infiammazione granulomatosa delle grandi arterie. I corticosteroidi sono la principale terapia, spesso combinata con farmaci immunosoppressori. Alcuni farmaci biologici sono disponibili per pazienti che sviluppano recidiva nonostante la terapia cortisonica o hanno avuto effetti avversi. Siccome alcuni pazienti rimangono refrattari, rimane necessario individuare nuovi target terapeutici. Un'esigenza clinica nella LVV è la mancanza di un approccio standardizzato per valutare l’attività di malattia. I marcatori infiammatori convenzionali non sempre riflettono l’infiammazione vascolare e servirebbero biomarcatori specifici di malattia per distinguere fase attiva e remissione. Il primo progetto mira a: i) investigare l’espressione dei membri dell’IL-1 nella GCA e le loro associazioni con le caratteristiche cliniche dei pazienti; ii) valutare gli effetti del trattamento con IL-1β sul trascrittoma delle colture primarie di arteria temporale (TABs); iii) valutare gli effetti dell’inibizione dell’IL-1β nelle TABs infiammate in vitro. Il secondo progetto mira a identificare possibili biomarcatori solubili per monitorare l’attività di malattia. L’influenza del tipo di matrice nel rilevamento degli immuno-checkpoint solubili (sICs) è stata valutata come scopo di medicina di laboratorio. PROGETTO 1. L’espressione dei membri dell’IL-1 è stata valutata in 38 TABs di pazienti con GCA e in TABs normali. IL-1β e IL-1RA erano presenti solo nelle TABs infiammate, mentre IL-18 era sovra-regolato nelle TABs infiammate. I livelli di espressione di queste citochine non correlavano con le caratteristiche cliniche, con la terapia cortisonica in atto alla biopsia, o la risposta alla terapia. I cambiamenti trascrittomici indotti da IL-1β sono stati investigati tramite RNAseq in colture primarie di TAB e validati tramite real-time PCR in diversi modelli cellulari (colture primarie di TAB, fibroblasti, monociti e linfociti). IL-1β up-regola la sua espressione e quella di altri geni (CCL2, CCL20, CSF3, IL-6, IL-8, IL-1RA, FGF-10, TNFα, IFNγ, IL-10, ICAM-1, VCAM-1, e SELE). L’effetto dell’inibizione dell’IL-1β è stato valutato trattando 11 TABs infiammate in vitro e valutando lo stesso pannello di geni. Il Canakinumab inibisce l’espressione dell’IL-1RA nelle TABs e riduce i livelli di IL-1β, GROα, e CCL3 nei surnatanti. Quindi, IL-1β può promuovere l’infiammazione vascolare e potrebbe essere un target terapeutico per la GCA. PROGETTO 2. Un pannello di 50 citochine, chemochine e fattori di crescita è stato valutato in siero e in plasma di 40 pazienti con LVV. I livelli plasmatici di FGF-2, IL-8 e MIP-1α diminuivano, mentre quelli sierici di BDNF, MCP-1 e SCF aumentavano in remissione. VEGF-A e MIG diminuivano in entrambe le matrici, suggerendo il loro possibile uso come biomarcatori di attività. Inoltre, sono stati quantificati 17 sICs. I livelli di VISTA diminuivano nel plasma, mentre quelli di ICOSL aumentavano nel siero dalla fase attiva alla remissione. Per valutare l’effetto matrice, gli stessi sICs sono stati analizzati nel siero e nel plasma di 38 pazienti sani. Dodici sICs su 17 erano comparabili tra siero e plasma. CD137, CD152, CD40, CD40L e LAG3 sono stati rilevati più frequentemente nel plasma, mentre CD40L nel siero. I livelli di PD-L2 erano più alti nel siero, mentre quelli di CD27 e VISTA nel plasma. CD27, CD80, GITRL, ICOSL, TIM3 e LAG3 hanno mostrato una leggera correlazione tra la concentrazione plasmatica e quella sierica. Questi risultati sottolineano la necessità di una scelta accurata della matrice per il rilevamento dei sICs