Meccanismi on-target di farmaci innovativi antitumorali e anti-infettivi studiati mediante approcci biochimici e biofisici

This doctoral thesis presents a translational strategy for on-target drug discovery integrating biochemical, biophysical, and cellular methodologies to elucidate molecular mechanisms and establish reliable assay platforms bridging mechanistic biology with pharmaceutical application. The goal is to design accurate and scalable systems for quantifying target engagement and modulation, enabling the identification of therapeutic agents capable of overcoming drug resistance, a major challenge in oncology and neglected diseases. Three complementary research lines address distinct but conceptually related molecular systems: Project I – Investigating the translational repression activity of Human Thymidylate Synthase to overcome drug resistance. This project examined the post-transcriptional regulation of hTS through single-molecule and biochemical approaches. Optical-tweezers experiments unveiled the unfolding profile of the hTS mRNA binding site, revealing structural determinants of protein–RNA recognition. In parallel, a bicistronic dual-luciferase assay was established to quantify hTS-dependent translational repression and test dimer destabilizers (DDiS), small molecules able to dissociate the active dimer into inactive monomers. DDiS inhibited hTS catalysis while preserving RNA binding, preventing the compensatory overexpression responsible for resistance to 5-fluorouracil and antifolates. Project II – Targeting the YAP–TEAD Interaction: biophysical assay development and hit identification for cancer drug discovery. This work focused on the YAP–TEAD protein–protein interaction, a pivotal hub of the Hippo signaling cascade. A fluorescence-anisotropy displacement assay was designed to quantify small-molecule competition at the TEAD4–YAP interface. In silico screening, molecular dynamics, and targeted synthesis identified pyrazolo-piperidinone derivatives as high-affinity TEAD4 ligands with low-nanomolar dissociation constants and antiproliferative activity in colorectal and ovarian cancer cells. The assay was miniaturized and automated at the Fraunhofer Institute (Hamburg) into a high-throughput format using acoustic dispensing and advanced plate readers, showing excellent reproducibility and robust Z′-factors suitable for large-scale screening. Project III – Exploring Benzothiophene–Flavonoids as novel antileishmanial candidates. This section addressed the urgent need for new therapeutics against leishmaniasis, a neglected tropical disease characterized by toxicity and rising resistance to existing drugs. The benzothiophene–flavonoid compound H80 was characterized through time-to-kill assays, fluorescence microscopy, and quantitative proteomics. Results revealed selective parasite uptake, perturbation of mitochondrial and redox homeostasis, and metabolic modulation consistent with selective toxicity. ADMET and ecotoxicological profiling confirmed a favorable pharmacological index, supporting H80 as a promising lead for host–parasite-targeted therapy. This thesis demonstrates how the rational design of biophysically validated assays enables the transition from molecular insight to translational pharmacology. Mechanistic precision and assay scalability emerge as key factors for discovering compounds able to counteract resistance, contributing to the framework of next-generation drug discovery

Questa tesi di dottorato presenta una strategia traslazionale per la scoperta di farmaci “on-target”, integrando metodologie biochimiche, biofisiche e cellulari per chiarire i meccanismi molecolari e stabilire piattaforme di saggio affidabili che colleghino la biologia meccanicistica all’applicazione farmaceutica. L’obiettivo è progettare sistemi accurati e scalabili per quantificare l’interazione e la modulazione del target, consentendo l’identificazione di agenti terapeutici capaci di superare la resistenza ai farmaci, una delle principali sfide in oncologia e nelle malattie neglette. Tre linee di ricerca affrontano sistemi molecolari distinti ma concettualmente correlati: Progetto I – Investigare l’attività di repressione traslazionale della Timidilato Sintasi Umana per superare la resistenza ai farmaci Questo progetto ha esaminato la regolazione post-trascrizionale della hTS attraverso approcci a singola molecola e biochimici. Gli esperimenti con pinzette ottiche hanno rivelato il profilo di svolgimento del sito di legame dell’mRNA della hTS, evidenziando i determinanti strutturali del riconoscimento proteina–RNA. In parallelo, è stato sviluppato un saggio bicistronico a doppia luciferasi per quantificare la repressione traslazionale dipendente da hTS e testare i dimer destabilizers (DDiS), piccole molecole capaci di dissociare il dimero attivo in monomeri inattivi. I DDiS hanno inibito la catalisi della hTS mantenendo il legame con l’RNA, prevenendo la sovraespressione compensatoria responsabile della resistenza a 5-fluorouracile e antifolati. Progetto II – Targeting dell’interazione YAP–TEAD: sviluppo di saggi biofisici e identificazione di “hit” per la scoperta di farmaci anticancro Questo lavoro si è concentrato sull’interazione proteina–proteina YAP–TEAD, un nodo cruciale della cascata di segnalazione Hippo. È stato progettato un saggio di spiazzamento basato sull’anisotropia di fluorescenza per quantificare la competizione di piccole molecole all’interfaccia TEAD4–YAP. Lo screening in silico, la dinamica molecolare e la sintesi mirata hanno identificato derivati pirazolo-piperidinonici come ligandi TEAD4 ad alta affinità, con costanti di dissociazione a basso nanomolare e attività antiproliferativa in cellule di carcinoma colorettale e ovarico. Il saggio è stato miniaturizzato e automatizzato presso il Fraunhofer Institute (Amburgo) in un formato ad alto rendimento mediante dispensazione acustica e lettori di piastra avanzati, mostrando un’eccellente riproducibilità e fattori Z′ robusti, adatti a screening su larga scala. Progetto III – Esplorazione dei Benzotiofene–Flavonoidi come nuovi candidati antileishmaniosi Questa sezione ha affrontato l’urgente necessità di nuovi terapeutici contro la leishmaniosi, una malattia tropicale negletta caratterizzata da tossicità e crescente resistenza ai farmaci esistenti. Il composto benzotiofene–flavonoide H80 è stato caratterizzato tramite saggi “time-to-kill”, microscopia a fluorescenza e proteomica quantitativa. I risultati hanno rivelato un’assunzione selettiva da parte del parassita, la perturbazione dell’omeostasi mitocondriale e redox, e una modulazione metabolica coerente con una tossicità selettiva. La profilazione ADMET ed ecotossicologica ha confermato un indice farmacologico favorevole, supportando H80 come promettente molecola guida per una terapia mirata ospite–parassita. Questa tesi dimostra come la progettazione razionale di saggi validati biofisicamente consenta la transizione dall’intuizione molecolare alla farmacologia traslazionale. La precisione meccanicistica e la scalabilità dei saggi emergono come fattori chiave per la scoperta di composti capaci di contrastare la resistenza, contribuendo al quadro della prossima generazione di scoperta di farmaci.