Interdomain communication in protein folding and allostery - the case of Grb2 protein

Proteins have evolved by increasing their structural complexity through the combination of multiple domains. Most proteins are multidomain: two-thirds of all prokaryotic proteins and over 80% of eukaryotic proteins contain more than one domain. Although multidomain proteins constitute the majority of the proteome, biophysical studies on these complex systems have only begun recently. This study presents two examples illustrating how the behavior of a single domain changes within its natural multidomain context. The experimental system used was the adaptor protein Grb2, composed of a central SH2 domain flanked by two SH3 domains. In the first part of the study, the influence of the SH2 domain on the binding activity of the C-SH3 domain was explored using an approach that combines mutagenesis and biophysical measurements, revealing allosteric interactions within the multidomain protein. This study shows that the allosteric effects of Grb2 are subtle and detectable only through extensive analysis, identifying an allosteric site at the SH2–C-SH3 interface, which may represent a potential target for modulating the selectivity of the C-SH3 domain. These findings suggest that Grb2 acts as an active signal integrator rather than a passive adaptor, with its function finely tuned by interdomain allosteric modulation. The second part of the thesis focuses on comparing the folding pathways of full-length Grb2 and the SH2 domain expressed in isolation. While the isolated domain generally folds according to a minimally frustrated energy landscape, in the multidomain context, interdomain interactions can modify the frustration pattern, increasing the likelihood of misfolded states. Although modular organization enhances the functional versatility of proteins, it also introduces greater complexity into the folding process, as domains must contend not only with their intrinsic energy landscapes but also with possible interdomain interactions. Kinetic unfolding and refolding experiments, combined with Φ-value analysis and in silico studies, made it possible to identify the patterns responsible for Grb2 misfolding, providing new insights into the mechanisms of communication and coordination between domains in complex multidomain systems.

Le proteine si sono evolute aumentando la loro complessità strutturale attraverso la combinazione di più domini. La maggior parte delle proteine è multidominio: due terzi di tutte le proteine procariotiche e oltre l’80% di quelle eucariotiche contengono più di un dominio. Sebbene le proteine multidominio costituiscano la maggior parte del proteoma, le ricerche biofisiche su questi sistemi complessi sono iniziate solo di recente. Questo studio presenta due esempi che mostrano come il comportamento di un singolo dominio cambi nel suo naturale contesto multidominio. Il sistema sperimentale utilizzato è stata la proteina adattatrice Grb2, composta da un dominio SH2 centrale affiancato da due domini SH3. Nella prima parte dello studio, è stato esplorato come il dominio SH2 influenzi l’attività di legame del dominio C-SH3, utilizzando un approccio che combina mutagenesi e misurazioni biofisiche rivelando interazioni allosteriche all’interno della proteina multidominio. Questo studio evidenzia come gli effetti allosterici di Grb2 siano sottili e osservabili solo mediante un’analisi approfondita, che ha permesso di individuare un sito allosterico localizzato all’interfaccia tra i domini SH2 e C-SH3. Tale sito potrebbe rappresentare un potenziale target per modulare la selettività del dominio C-SH3. Da queste osservazioni si può dedurre che Grb2 non agisca come un semplice adattatore passivo, ma come un integratore attivo di segnali, capace di regolare la propria funzione attraverso una modulazione allosterica specifica mediata da comunicazioni interdominio. La seconda parte della tesi si concentra sul confronto dei percorsi di folding di Grb2 a lunghezza intera e del dominio SH2 espresso in isolamento. Il dominio isolato si ripiega generalmente secondo un paesaggio energetico minimamente frustrato, nel contesto multidominio le interazioni tra domini possono modificare il pattern di frustrazione, aumentando la probabilità di stati mal ripiegati. Sebbene l’organizzazione modulare aumenti la versatilità funzionale delle proteine, introduce anche una maggiore complessità nel processo di folding, in quanto i domini devono affrontare non solo i propri paesaggi energetici intrinseci, ma anche possibili interazioni inter-domini. Esperimenti cinetici di unfolding e refolding, combinati con Φ-value analysis e studi in silico, hanno permesso di identificare i pattern responsabili del misfolding di Grb2, fornendo nuove informazioni sui meccanismi di comunicazione e coordinazione tra domini in sistemi multidominio complessi.