PRE-NUCLEATION IN MOLECULAR LIQUIDS: A MOLECULAR DYNAMICS PERSPECTIVE

Crystals are ubiquitous in everyday life and play a central role in pharmaceuticals, the food industry, and materials science, enabling a wide range of advanced technological applications. Despite their importance, the initial stage of crystal formation, i.e. nucleation, remains poorly understood. Experimental techniques are largely insensitive to nucleation due to the extremely high spatial and temporal resolution and sensitivity required, while computational approaches are challenged by the rare-event nature of nucleation, which demands long simulations of large systems. In this work, pre-nucleation phenomena such as partial ordering and aggregation in molecular liquids are investigated through a combination of computer simulations and crystallization experiments. This research pursues three main objectives: first, to study the effect of confinement on the partial ordering of molecular liquids; second, to investigate the formation and properties of subcritical clusters during the pre-nucleation stage; and third, to explore the role of aromatic stacking interactions in pre-nucleation phenomena. Benzoic acid was selected as the model compound owing to its limited molecular flexibility, small number of atoms, and ability to engage in a variety of intermolecular interactions, including hydrogen bonding and aromatic stacking. Some derivatives were also examined for comparison. The primary methodologies employed include molecular dynamics (MD) simulations using the MiCMoS software, static energy calculations with the PIXEL method, DFT-D calculations, and crystallization experiments performed with the Crystal16 multi-reactor crystallizer. To address the first objective, a confining algorithm was developed and implemented in MiCMoS. Exploratory MD simulations of up to eight benzoic acid molecules confined within small cubic nanocavities were carried out to analyze aggregation behavior and interaction motifs, while DFT-D calculations were used to assess the stability of cyclic aggregates. Subsequently, simulations of confined liquids were performed in different geometries, ranging from nanolayers to nanotubes and nanocavities. Compared to the unconfined bulk liquid, confinement leads to an increase in viscosity and enhanced stacking interactions, driven by partial ordering near the confining barriers, where adsorbed molecular layers form. Increasing the stiffness of confinement induces a liquid-liquid transition between low-density and high-density states in nanocavities. Confinement was further pushed to the limit by adopting a nanolayer geometry allowing only a single molecular layer, in which a catemeric aggregate composed of 26 molecules was observed. This aggregate closely resembles a motif previously identified in crystal structure prediction studies and suggests that, under these conditions, access to a previously unobserved polymorphic form of benzoic acid, reported as monomorphic to date, may be possible. The second objective focuses on nanoscale inhomogeneities in bulk liquids. Density fluctuations are significantly enhanced in the undercooled liquid, likely due to the formation of larger and more persistent aggregates, identified as subcritical clusters. To investigate these features, a dedicated analysis tool was developed to characterize aggregate formation, and a new definition of subcritical clusters was introduced based on interaction energy, time persistence, and excess energy, which measures whether the cohesive energy of an aggregate exceeds its interactions with the surrounding liquid. Aggregate size distributions reveal trimers as the most abundant species, while dimers, corresponding to the dominant motif in the crystal structure, are the second most common. However, these aggregates are too small to qualify as subcritical clusters. The largest and most persistent subcritical cluster is observed in the undercooled liquid and consists of 17 molecules with a lifetime exceeding 130 ps. This cluster adopts a globular shape formed by a folded chain of hydrogen-bonded molecules, with intermittent aromatic stacking interactions contributing to its stabilization. The third objective addresses the role of aromatic stacking interactions in nucleation. Approximately 200 dimeric structures of benzoic acid derivatives were retrieved from the Cambridge Structural Database (CSD), and their stacking energies were estimated using the PIXEL method. After applying a series of selection criteria, four candidate compounds were identified for experimental investigation. Kinetic solubility was screened in several solvents, and isopropanol was selected as the most suitable. Following an accurate determination of thermodynamic solubility, one compound was excluded due to insolubility and another due to time reasons. The remaining two compounds were subjected to crystallization experiments using Crystal16 to determine nucleation rates. Owing to the stochastic nature of nucleation, 80 repetitions were performed at five different supersaturation levels, yielding a total of 400 experiments per compound. Nucleation rates were obtained by fitting the cumulative probability of nucleation as a function of induction time. Complementary MD simulations were conducted to correlate nucleation propensity with aromatic stacking interactions, supported by the development of a new analysis tool specifically designed to characterize stacking behavior. Compounds exhibiting higher nucleation propensities also display stronger stacking energies, a greater number of stacking interactions with longer lifetimes, and the formation of larger stacked aggregates. These aggregates adopt pillar-like arrangements reminiscent of crystal packing motifs, while still retaining a significant degree of structural disorder.

I cristalli sono molto diffusi nella vita quotidiana e svolgono un ruolo centrale nei settori farmaceutico, alimentare e della scienza dei materiali, consentendo un’ampia gamma di applicazioni tecnologiche avanzate. Nonostante la loro importanza, la fase iniziale della cristallizzazione, la nucleazione, rimane ancora poco chiara. Le tecniche sperimentali sono in gran parte cieche alla nucleazione a causa delle elevate richieste in termini di risoluzione spaziale, temporale e sensibilità, mentre gli approcci computazionali sono messi alla prova dal fatto che la nucleazione è un evento raro, che richiede simulazioni di lunga durata su sistemi di grandi dimensioni. In questo lavoro, i fenomeni di pre-nucleazione, tra cui il parziale ordinamento e l’aggregazione nei liquidi molecolari, vengono investigati mediante una combinazione di simulazioni computazionali ed esperimenti di cristallizzazione. Questa ricerca ha tre obiettivi principali: innanzitutto, studiare l’effetto del confinamento sul parziale ordinamento dei liquidi molecolari; in secondo luogo, investigare la formazione e le proprietà dei cluster subcritici durante la fase di pre-nucleazione; infine, esplorare il ruolo delle interazioni di stacking aromatico nei fenomeni di pre-nucleazione. L’acido benzoico è stato selezionato come composto modello data la sua limitata flessibilità molecolare, il numero di atomi ridotto e la sua capacità di partecipare a diverse interazioni intermolecolari, inclusi il legame a idrogeno e lo stacking aromatico. Alcuni suoi derivati sono stati inoltre esaminati per fare un confronto. Le principali metodologie impiegate includono simulazioni di dinamica molecolare (MD) utilizzando il software MiCMoS, calcoli di energia statica mediante il metodo PIXEL, calcoli DFT-D ed esperimenti di cristallizzazione condotti con il cristallizzatore multi-reattore Crystal16. Per affrontare il primo obiettivo, è stato sviluppato e implementato un algoritmo di confinamento in MiCMoS. Sono state eseguite simulazioni esplorative di MD su sistemi contenenti fino a otto molecole di acido benzoico confinate all’interno di piccole nanocavità cubiche per analizzare il comportamento di aggregazione e i pattern di interazione, mentre sono stati utilizzati calcoli DFT-D per valutare la stabilità degli aggregati ciclici. Successivamente, sono state condotte simulazioni di liquidi confinati in diverse geometrie, da nanostrati a nanotubi e nanocavità. Rispetto al liquido bulk non confinato, il confinamento determina un aumento della viscosità e un’intensificazione delle interazioni di stacking, guidate dal parziale ordinamento in prossimità delle barriere di confinamento, dove si formano strati di molecole adsorbite. L’aumento della rigidità del confinamento induce una transizione liquido-liquido tra stati a bassa e ad alta densità nelle nanocavità. Il confinamento è stato spinto al limite adottando una geometria a nanostrato che consente la presenza di un solo strato molecolare, nella quale è stato osservato un aggregato catemerico costituito da 26 molecole. Questo aggregato ricorda un pattern identificato in precedenti studi di predizione della struttura cristallina e suggerisce che, in queste condizioni, sia possibile accedere a un nuovo polimorfo dell’acido benzoico, che allo stato attuale è monomorfo. Il secondo obiettivo è incentrato sulle disomogeneità su scala nanometrica nei liquidi bulk. Le fluttuazioni di densità risultano significativamente amplificate nel liquido surraffreddato, probabilmente a causa della formazione di aggregati più grandi e persistenti, identificati come cluster subcritici. A tal fine, è stato sviluppato un programma di analisi per caratterizzare la formazione degli aggregati ed è stata introdotta una nuova definizione di cluster subcritici basata sull’energia di interazione, sulla persistenza temporale e sull’energia in eccesso, una grandezza che misura se l’energia coesiva dell’aggregato supera le interazioni con il liquido circostante. Le distribuzioni delle dimensioni degli aggregati mostrano i trimeri come specie più abbondante, mentre i dimeri, che corrispondono al pattern dominante nella struttura cristallina, risultano essere i secondi più comuni. Tuttavia, tali aggregati sono troppo piccoli per essere qualificati come cluster subcritici. Il cluster subcritico più grande e persistente è osservato nel liquido surraffreddato ed è costituito da 17 molecole, con un tempo di vita superiore a 130 ps. Questo cluster adotta una forma globulare costituita da una catena ripiegata di molecole legate da legami a idrogeno, con interazioni di stacking aromatico intermittenti che contribuiscono alla sua stabilizzazione. Il terzo obiettivo affronta il ruolo delle interazioni di stacking aromatico nella nucleazione. Circa 200 strutture dimeriche di derivati dell’acido benzoico sono state ottenute dal Cambridge Structural Database (CSD) e le loro energie di stacking sono state stimate mediante il metodo PIXEL. Dopo l’applicazione di una serie di criteri, sono stati individuati quattro composti per l’analisi sperimentale. La solubilità cinetica è stata esaminata in diversi solventi ed è stato selezionato l’isopropanolo come il più idoneo. Dopo un’accurata determinazione della solubilità termodinamica, un composto è stato escluso perché insolubile e un altro per ragioni di tempo. I due composti rimanenti sono stati impiegati in esperimenti di cristallizzazione utilizzando il Crystal16 per determinare le velocità di nucleazione. A causa della natura intrinsecamente stocastica della nucleazione, sono state eseguite 80 ripetizioni usando cinque diversi livelli di sovrasaturazione, per un totale di 400 esperimenti per ciascun composto. Le velocità di nucleazione sono state determinate attraverso un fitting della probabilità cumulativa di nucleazione in funzione del tempo di induzione. Sono state condotte simulazioni complementari di MD per correlare la propensione alla nucleazione con le interazioni di stacking aromatico, supportate dallo sviluppo di un nuovo programma di analisi specificamente progettato per caratterizzare lo stacking. I composti che mostrano una maggiore propensione alla nucleazione presentano anche energie di stacking più favorevoli, un numero maggiore di interazioni di stacking con tempi di vita più lunghi e la formazione di aggregati stacked di dimensioni maggiori. Questi aggregati adottano disposizioni di tipo colonnare che richiamano i motivi di impaccamento cristallino, pur mantenendo un elevato grado di disordine strutturale.