Neutrophil heterogeneity and therapeutic opportunities of CXCL8-CXCR1/2 axis modulation in glioblastoma

I pazienti affetti da glioblastoma (GBM) presentano frequentemente neutrofilia, un aumento del rapporto neutrofili/linfociti (NLR) e livelli elevati di CXCL8, tutti fattori associati a una prognosi sfavorevole. Tuttavia, nel microambiente tumorale si riscontra generalmente un numero limitato di neutrofili e il loro ruolo, così come la loro eterogeneità, rimane poco compreso. Questa tesi si è proposta di chiarire le funzioni e la diversità fenotipica dei neutrofili nel GBM, con particolare attenzione all’asse chemochinico CXCL8–CXCR1/2 come potenziale bersaglio terapeutico. L’analisi citofluorimetrica del sangue periferico di pazienti affetti da GBM ha rivelato che un numero elevato di neutrofili correla con una prognosi peggiore. I neutrofili circolanti mostravano un fenotipo distinto rispetto a quelli di donatori sani, caratterizzato dall’espressione di CD177 e da livelli ridotti di CD10, CD54 e HLA-DR, indicativi di uno stato immaturo e immunosoppressivo. Un fenotipo simile è stato osservato anche nei neutrofili infiltranti il tumore. In vitro, CXCL8 ha indotto l’espressione di CD177 nei neutrofili, mantenendo bassi i livelli di CD10 e CD54, coerentemente con un fenotipo parzialmente maturo ma non classicamente attivato. Cambiamenti fenotipici analoghi sono stati osservati in seguito all’esposizione dei neutrofili isolati a mezzo condizionato da cellule di glioma, che ha inoltre promosso un profilo maggiormente immunosoppressivo. Per approfondire il ruolo funzionale dei neutrofili nel GBM, è stato stabilito un modello murino in vivo mediante iniezione intracranica di cellule SB28. I topi portatori di tumore, analogamente ai pazienti con GBM, hanno sviluppato neutrofilia, aumento del NLR e immaturità dei neutrofili. In modo rilevante, i topi neutropenici knock-out per CSF3R hanno mostrato una riduzione della crescita tumorale e una sopravvivenza prolungata rispetto ai controlli wild-type, confermando un ruolo pro-tumorale dei neutrofili in questo contesto. Inoltre, i neutrofili derivanti dal midollo osseo della teca cranica condividevano caratteristiche fenotipiche coerenti con i neutrofili associati al tumore (TANs), identificando il midollo cranico come un importante compartimento a supporto delle loro funzioni pro-tumorali. L’intervento terapeutico con Reparixin, un antagonista di CXCR1/2, ha ridotto significativamente la crescita del tumore SB28. È interessante notare che, sebbene il trattamento non abbia modificato il numero o il fenotipo dei neutrofili circolanti e infiltranti il tumore, ha aumentato la proporzione di neutrofili maturi trattenuti nel midollo osseo, probabilmente a causa di un’alterata mobilizzazione verso la circolazione periferica. In conclusione, questa tesi dimostra l’eterogeneità fenotipica dei neutrofili nel GBM e identifica CD177 come potenziale marcatore di neutrofili indotti dal tumore. Inoltre, evidenzia il ruolo pro-tumorale dei neutrofili e il contributo centrale dell’asse CXCL8–CXCR1/2, indicando questa via come un promettente bersaglio terapeutico per il trattamento del glioblastoma.

Glioblastoma (GBM) patients often present with neutrophilia, elevated neutrophil-to-lymphocyte ratios, and increased CXCL8 levels, all of which are associated with poor prognosis. However, only few neutrophils are typically found within the tumor microenvironment, and their role and heterogeneity remain poorly understood. This thesis aimed to elucidate the functions and phenotypic diversity of neutrophils in GBM, with a particular focus on the CXCL8–CXCR1/2 chemokine axis as a potential therapeutic target. Flow cytometric analysis of blood from GBM patients revealed that higher neutrophil counts correlated with worse prognosis. Circulating neutrophils displayed a distinct phenotype compared to those from healthy donors, characterized by CD177 expression and reduced levels of CD10, CD54, and HLA-DR, indicative of immature and immunosuppressive state. A similar phenotype was also observed in tumor-infiltrating neutrophils. In vitro, CXCL8 was found to induce neutrophil CD177 expression while maintaining low CD10 and CD54 levels, consistent with a partially matured yet non-classically activated phenotype. Similar phenotypic changes were observed upon exposure of isolated neutrophils to glioma-conditioned medium, which also promoted a more immunosuppressive profile. To further investigate neutrophil function in GBM, an in vivo glioma model was established by intracranial injection of SB28 cells. Tumor-bearing mice, similarly to GBM patients, developed neutrophilia, increased NLR, and neutrophil immaturity. Strikingly, neutropenic CSF3R knock out mice exhibited reduced tumor growth and prolonged survival compared to wild-type controls, confirming a pro-tumoral role of neutrophils in this setting. Moreover, neutrophils from the skull bone marrow shared consistent phenotypic features with tumor-associated neutrophils (TANs), identifying the skull marrow as a key niche supporting their tumor-promoting functions. Therapeutic intervention with Reparixin, a CXCR1/2 antagonist, significantly reduced SB28 tumor growth. Interestingly, while the drug did not alter the number or phenotype of circulating and infiltrating neutrophils, it increased the proportion of mature neutrophils retained in the bone marrow, likely due to impaired release into circulation. In conclusion, this thesis demonstrates the phenotypic heterogeneity of neutrophils in GBM and identifies CD177 as a potential marker of tumor-elicited neutrophils. Furthermore, it underscores the pro-tumoral role of neutrophils and the central contribution of the CXCL8–CXCR1/2 axis, highlighting this pathway as a promising therapeutic target for GBM.