Filogenesi multi-genica per un nuovo approccio alla tassonomia dei Gastrotrichi

The phylum Gastrotricha comprises microscopic marine and freshwater invertebrates, predominantly benthic, found worldwide. The approximately 900 known species are divided into the two orders Chaetonotida and Macrodasyida, each with many genera and at least ten families. However, the use of molecular data has revealed that many groups are not monophyletic, questioning the validity of the morphological traits used in traditional classification. More recently, modern microscopy techniques and molecular-based phylogenetic analyses have enabled more accurate descriptions and more robust classifications. Nonetheless, the single-marker approach (18S rDNA) and limited taxonomic sampling have shown limitations in resolving deep evolutionary relationships. This research addresses these challenges through multigene phylogenetic analyses, extensive taxonomic sampling, and the application of advanced technologies, including Whole Genome Amplification (WGA), Next Generation Sequencing (NGS), and bioinformatics tools. The thesis is structured as a collection of articles and consists of four chapters. The first two are dedicated to the genus Urodasys, characterized by a long tail and a remarkable variety of reproductive structures. The first chapter describes a new species using DIC and CLSM microscopy, with a morpho-functional analysis of the reproductive system, particularly the copulatory organ and the stylet. The second chapter presents a multigene phylogenetic analysis (18S rDNA, 28S rDNA, COI mtDNA) of several species, suggesting that the common ancestor of these species had paired gonads and accessory organs, and that the stylet evolved within the copulatory organ before the loss of the left testis. The third chapter analyses the phylogenetic relationships of the order Macrodasyida on a multigene basis and a broad taxonomic sampling, particularly of the families Cephalodasyidae and Macrodasyidae, revealing their polyphyly. A new classification is proposed, introducing two families (Mesodasyidae n.fam. and Urodasyidae n.fam.) and a new genus (Paraurodasys n.gen.). Furthermore, Dolichodasys and Paradasys are assigned to the Redudasyidae, while Cephalodasys mahoe is transferred to the genus Paradasys. The fourth chapter explores the mitochondrial genome of 20 species representative of the ecological and reproductive diversity of the phylum. Comparative analysis identifies significant differences between between Macrodasyida and Chaetonotida: members of the Oiorpata group (Chaetonotida) exhibit a conserved genomic structure, indicative of evolutionary stasis, while Macrodasyida exhibit variability in gene arrangement, strand polarity, and the presence of repeats. These differences appear to reflect reproductive strategies (parthenogenesis vs. hermaphroditism) and habitats (freshwater vs. marine), but are more likely to result from gene drift. Phylogenetic analysis of mitochondrial protein coding genes supports the proposed new classification for Macrodasyida based on nuclear and COI genes, and suggests a possible marine origin for the Chaetonotida Oiorpata. Unfortunately, the origin and phylogenetic alliances of Neodasys remain unresolved. In summary, the multigenic molecular approach and expanded taxonomic sampling have improved the statistical support of phylogenetic analyses, offering new insights into the evolution, taxonomy, and genetic diversity of gastrotrichs. The same approach could be applied to resolve issues not addressed in this project. From this perspective, the main challenge will be finding a sufficient number of target species, which are often rare or endemic to remote and difficult-to-access geographical areas.

Il phylum Gastrotricha comprende microscopici invertebrati marini e d’acqua dolce, prevalentemente bentonici, presenti in tutto il mondo. Le circa 900 specie note sono suddivise nei due ordini Chaetonotida e Macrodasyida, ciascuno con decine di generi e almeno una decina di famiglie. Tuttavia, l’uso di dati molecolari ha rivelato che molti gruppi non sono monofiletici, mettendo in dubbio la validità dei tratti morfologici usati nella classificazione tradizionale. Più di recente, le moderne tecniche di microscopia e le analisi filogenetiche basate su dati molecolari hanno permesso descrizioni più accurate e classificazioni più solide. Tuttavia, l’approccio basato su un solo marcatore (18S rDNA) e un campionamento tassonomico limitato ha mostrato limiti nella risoluzione dei rapporti evolutivi profondi. Questo lavoro affronta tali problematiche mediante analisi filogenetiche multigeniche, un ampio campionamento tassonomico e l’impiego di tecnologie avanzate come Whole Genome Amplification (WGA), Next Generation Sequencing (NGS) e strumenti bioinformatici. La tesi è strutturata come raccolta di articoli e si compone di quattro capitoli. I primi due sono dedicati al genere Urodasys, caratterizzato da una lunga coda e una notevole varietà di strutture riproduttive. Il primo capitolo descrive una nuova specie tramite microscopia DIC e CLSM, con un’analisi morfo-funzionale dell’apparato riproduttore, in particolare dell’organo copulatore e dello stiletto. Il secondo capitolo presenta un’analisi filogenetica multigenica (18S rDNA, 28S rDNA, COI mtDNA) su diverse specie, suggerendo che l’antenato comune possedesse gonadi pari e organi accessori, e che lo stiletto si sia evoluto all’interno dell’organo copulatore prima della perdita del testicolo sinistro. Il terzo capitolo analizza le relazioni filogenetiche dei Macrodasyida su base multigenica e un ampio campionamento tassonomico, in particolare delle famiglie Cephalodasyidae e Macrodasyidae, rivelandone la polifilia. Viene proposta una nuova classificazione con l’introduzione di due famiglie (Mesodasyidae n.fam. e Urodasyidae n.fam.) e un nuovo genere (Paraurodasys n.gen.). Inoltre, Dolichodasys e Paradasys vengono assegnati ai Redudasyidae, mentre Cephalodasys mahoe è trasferito al genere Paradasys. Il quarto capitolo esplora il genoma mitocondriale di 20 specie rappresentative della diversità ecologica e riproduttiva del phylum. L’analisi comparativa mostra forti differenze tra Macrodasyida e Chaetonotida: i membri del gruppo Oiorpata (Chaetonotida) presentano una struttura genomica conservata, indicativa di stasi evolutiva, mentre i Macrodasyida mostrano variabilità nella disposizione genica, polarità dei filamenti e presenza di ripetizioni. Queste differenze sembrano riflettere le strategie riproduttive (partenogenesi vs ermafroditismo) e gli habitat (acqua dolce vs marino), ma è più probabile che derivino da fenomeni di drift genico. L’analisi filogenetica dei geni mitocondriali codificanti supporta la nuova classificazione proposta per i Macrodasyida sulla base dei geni nucleari e COI, e suggerisce una possibile origine marina del gruppo Oiorpata; purtroppo, origine e alleanze filogenetiche di Neodasys restano punti irrisolti. In sintesi, l’approccio molecolare multigenico e l’ampliamento del campionamento tassonomico hanno migliorato il supporto statistico delle analisi filogenetiche, offrendo nuove prospettive sull’evoluzione, la tassonomia e la diversità genetica dei gastrotrichi. Lo stesso approccio potrebbe essere applicato per la risoluzione di problematiche non affrontate in questo progetto. In tale prospettiva, la principale criticità consisterà nel reperimento di un numero sufficiente di specie target, spesso rare o endemiche di aree geografiche remote e di difficile accesso.