Studio focalizzato sulla MAPK pathway e sull'intorno molecolare di KRASG12D nel cancro al colon attraverso l'utilizzo di organoidi derivanti da pazienti per il trattamento personalizzato

Colorectal Cancer (CRC) comprises a complex family of tumors different for morphology, immune infiltration, drug response and genetic alterations, including APC/KRAS/TP53/SMAD4. Mutations in KRAS oncogene, mostly at codons 12 and 13, are associated with CRC initiation and progression, but they are missing in clinics of target inhibitors. Patient-derived Organoids (PDOs) have been demonstrated a cutting-edge 3D in vitro model suitable for drug testing, since they resemble the patient specifics. Considering inter and intra-patient heterogeneity as relevant factors affecting treatment efficacy, we aimed to study the effects of MAPK pathway inhibition at multiple levels along EGFR-ERK axis to characterize the molecular landscape of KRASG12D-targeted perturbed system in CRC. We designed a specific drug screening protocol to screen 12 CRC PDOs presenting KRASG12*/G13*, KRAS**, KRASWT and BRAFV600E, and we used a personalized KRAS/MAPK-targeting drug panel to identify differences in drugs vs patient response based on KRAS status. We included the novel KRASG12D inhibitor MRTX1133 to test the efficacy in KRASG12D targeting and identify the drug/activity range in CRC. We identified trametinib (MEKi) as the most effective inhibitor of the MAPK pathway (low pM EC50), while MRTX1133 had an on-target effect at 20pM-1uM range exclusively in KRASG12D CRC PDOs. We demonstrated the capability of both MRTX1133 and trametinib in downregulating pERK expression in western blot, and we compared the KRASG12D-targeted protein landscape with the MEK-targeted protein landscape using proteomic and phospoproteomic analysis. We showed a unique phosphoprotein perturbed pattern different for each MRTX1133 treated KRASG12D CRC PDOs, including MAPK, ribosomal protein, PI3K/AKT and cell cycle components. Lastly, we demonstrated CyclinD1 downregulation with western blot and cell cycle blockade with FACS following MRTX1133 treatment, and we hypothesized CyclinD1-dependent cell cycle blockade as possible mechanism leading to cell death in MRTX1133 treated KRASG12D CRC PDOs. Our CRC PDO model greatly strengthens the use of patient-derived 3D in vitro cultures as a more reliable platform to explore new therapeutic strategies in CRC precision medicine, and pointed out mutation-driven perturbed systems, as for KRASG12D.

Il cancro al colon (CRC) comprende una famiglia complessa di tumori diversi per morfologia, infiltrazione del sistema immunitario, risposta ai farmaci e mutazioni genetiche, tra cui APC/KRAS/TP53/SMAD4. Le mutazioni nell'oncogene KRAS, soprattutto ai codoni 12 e 13, sono associate all'inizio e alla progressione del CRC, ma mancano in clinica di trattamenti bersaglio-specifici. Gli organoidi derivanti da pazienti (PDOs) sono stati dimostrati una nuova tecnologia di modello in vitro 3D utilizzabili per testare farmaci, dal momento che presentano le medesime caratteristiche del paziente. Considerando che l'eterogeneità tra pazienti e del paziente stesso sono entrambi fattori rilevanti che influenzano l'efficacia terapeutica, il nostro scopo è stato quello di studiare gli effetti dell'inibizione della pathway della MAPK a diversi livelli lungo l'asse EGFR-ERK, per caratterizzare l'intorno molecolare di KRASG12D dopo perturbazione da trattamento specifico in CRC. Abbiamo disegnato un protocollo di screening di farmaci per testare 12 CRC PDOs che presentano KRASG12*/G13*, KRAS**, KRASWT e BRAFV600E, e abbiamo utilizzato un pannello di farmaci KRAS/MAPK-specifico per identificare le differenze di risposta dei pazienti ai farmaci a seconda dello stato di mutazione di KRAS. Abbiamo incluso l'MRTX1133, un nuovo inibitore di KRASG12D, per testarne l'efficacia nell'inibizione specifica di KRASG12D e identificarne lo spettro di attività in CRC. Abbiamo identificato il trametinib (inibitore MEK-specifico) come il più efficace inibitore della MAPK (bassa EC50, nell'ordine di grandezza del pM), mentre l'MRTX1133 ha confermato un'attività sul bersaglio specifica di inibizione di KRASG12D nel range di 20pM-1uM, esclusivamente in KRASG12D CRC PDOs. Abbiamo dimostrato la capacità di entrambi, MRTX1133 e trametinib, di ridurre l'espressione di pERK in western blot, e abbiamo confrontato l'intorno molecolare di KRASG12D-specifico inibito con quello di MEK-specifico inibito utilizzando analisi di proteomica e di fosfoproteomica. Abbiamo mostrato un pattern di perturbazione di fosfoproteine unico e differente per ciascun KRASG12D CRC PDO trattato con MRTX1133, che include componenti della MAPK, proteine ribosomiali, PI3K/AKT e componenti del ciclo cellulare. In ultimo, abbiamo dimostrato la riduzione dell'espressione della CiclinaD1 con western blot e l'avvenimento del blocco del ciclo cellulare con FACS dopo il trattamento con l'MRTX1133, e abbiamo ipotizzato che il blocco del ciclo cellulare dipendente dall'espressione della proteina CiclinaD1 rappresenti il possibile meccanismo che induce a morte cellulare nei KRASG12D CRC PDOs trattati con MRTX1133. Il nostro modello di CRC PDO rafforza l'uso di modelli 3D in vitro derivanti da pazienti come piattaforma più accurata per esplorare nuove strategie terapeutiche nella medicina di precisione del CRC, e ha dimostrato uno determinato sistema di perturbazione dipendente da una mutazione specifica, come KRASG12D.