Caratterizzazione del ruolo della piccola proteina da shock termico HSPB3 durante il differenziamento di neuroni motori e cellule del muscolo scheletrico e durante la maturazione delle giunzioni neuromuscolari

HSPB3 is considered the most deviating member of the small heat shock protein family (sHSP or HSPB). HSPBs are ATP-independent chaperones that participate in the cellular response to stress and protein misfolding. Unlike other sHSPs, HSPB3 is not upregulated in response to heat shock and exhibits a limited chaperone activity. Its expression is restricted to a few cell types, primarily skeletal muscle cells (SkMCs), and motor neurons (MNs). Moreover, HSPB3 is absent in pluripotent stem cells and proliferating myoblasts, while it is upregulated during myogenesis. Importantly, its loss impairs the activation of myogenic transcriptional program, thus compromising SkMC differentiation. Whether and how HSPB3 may also play a role during MN differentiation is currently unknown. Yet, genetic variants of HSPB3 are associated with distal hereditary motor neuropathy (dHMN), Charcot-Marie-Tooth type 2 (CMT2), and congenital myopathy with neuropathy signs, highlighting the need to better elucidate its physiological functions at the level of the neuromuscular system. The diseases associated with HSPB3 variants are characterized by repeated cycles of muscle denervation and reinnervation that destabilize the neuromuscular junction (NMJ), leading to degeneration of MNs. Since postnatal differentiation of MNs and SkMCs is essential for the maintenance and regeneration of the neuromuscular system, this thesis aimed to understand if HSPB3 participates in MN differentiation and in the build-up of NMJs and how its mutations contribute to disease onset. Using CRISPR/Cas9, we generated HSPB3 knockout (KO) induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as iPSC lines carrying homozygous disease-associated variants (HSPB3-R116P and HSPB3-Y118H). We observed that HSPB3 expression is induced during iPSC differentiation into MNs, and that its loss or mutation deregulates the expression of gene pathways critical for MN development, resulting in defective dendritic arborization. HSPB3 KO also altered the transcriptome of differentiating SkMCs, downregulating the expression of key components of the extracellular matrix and NMJs, as well as genes that sustain muscle regeneration. As a result, HSPB3 KO impaired the maturation of NMJs in iPSC-derived co-cultures of MNs and SkMCs. These results suggest that HSPB3 plays a crucial role in the build-up of NMJs by promoting the postnatal differentiation of MNs and SkMCs. Importantly, deleting HSPB3 selectively in MNs was sufficient to delay NMJ maturation, highlighting its critical function at the level of MNs. We then sought to investigate the molecular mechanisms underlying HSPB3 function. Combining microscopy, mass spectrometry, and chromatin-immunoprecipitation, we found that HSPB3 participates in chromatin remodeling during the early steps of differentiation. Based on our results, we propose that dysregulation of HSPB3 expression or function, due to pathogenic variants, impairs the transcriptional regulation in MNs and SkMCs, thereby affecting dendritic arborization, neuronal communication and ultimately delaying the build-up of NMJs. Reduced NMJ plasticity during aging may thus enhance the vulnerability of the neuromuscular system to stress and damage, accelerating its degeneration.

HSPB3 è ritenuta il membro più atipico tra le piccole proteine da shock termico (HSPB). Le HSPB sono chaperoni ATP-indipendenti coinvolti nella risposta cellulare allo stress e al ripiegamento scorretto delle proteine. A differenza di altri membri della stessa famiglia, HSPB3 non viene indotta in risposta a stress termico e presenta una limitata attività di chaperon. La sua espressione è ristretta a pochi tipi cellulari, principalmente motoneuroni (MN) e cellule del muscolo scheletrico. Inoltre, HSPB3 è assente in cellule staminali pluripotenti e nei mioblasti in fase di replicazione, mentre viene espressa durante la miogenesi. La sua rimozione altera l’attivazione del programma trascrizionale miogenico, compromettendo il differenziamento delle cellule muscolari. Non è ancora chiaro invece se e come HSPB3 sia coinvolta anche durante il differenziamento dei MN. Tuttavia, varianti genetiche di HSPB3 sono associate a neuropatia motoria ereditaria distale, malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2 e miopatia congenita con segni di neuropatia, evidenziando la necessità di capire meglio le sue funzioni fisiologiche nel sistema neuromuscolare. Le patologie associate con varianti di HSPB3 sono caratterizzate da cicli ripetuti di denervazione e reinnervazione muscolare che destabilizzano le giunzioni neuromuscolari e portano alla degenerazione dei MN. Poiché il differenziamento postnatale di MN e miociti è essenziale per il mantenimento e la rigenerazione del sistema neuromuscolare, lo scopo di questa tesi è comprendere se HSPB3 sia coinvolta nel differenziamento dei MN e nella formazione delle giunzioni neuromuscolari, e come le sue mutazioni contribuiscano allo sviluppo delle patologie. Attraverso CRISPR/Cas9 è stato rimosso il gene HSPB3 in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e sono anche state generate linee di iPSC portatrici di varianti patogeniche in omozigosi (HSPB3-R116P e HSPB3-Y118H). Si è osservato che l’espressione di HSPB3 è indotta durante il differenziamento delle iPSC in MN e che la sua rimozione o mutazione altera l’espressione di geni essenziali per lo sviluppo dei MN, riducendo la complessità dell’arborizzazione dendritica. La perdita di HSPB3 modifica anche il trascrittoma durante il differenziamento delle cellule muscolari, riducendo l’espressione di componenti chiave della matrice extracellulare e delle giunzioni neuromuscolari, e di geni che promuovono la rigenerazione muscolare. Di conseguenza, si è osservato che l’assenza di HSPB3 compromette la maturazione delle giunzioni neuromuscolari in co-colture di MN e miociti derivati da iPSC. Questi risultati suggeriscono che HSPB3 svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo delle giunzioni neuromuscolari, promuovendo il differenziamento postnatale di MN e miociti. Inoltre, rimuovere HSPB3 esclusivamente nei MN è stato sufficiente a ritardare la maturazione delle giunzioni, evidenziandone la funzione cruciale a livello neuronale. In seguito, sono stati effettuati esperimenti di microscopia, spettrometria di massa e immunoprecipitazione della cromatina per studiare i meccanismi molecolari alla base della funzione di HSPB3, rivelando che HSPB3 partecipa al rimodellamento della cromatina nelle fasi iniziali del differenziamento. Questi risultati suggeriscono che la disregolazione dell’espressione o della funzione di HSPB3, dovuta a varianti patogeniche, comprometta la regolazione trascrizionale nei MN e nelle cellule muscolari, alterando la ramificazione dendritica, la comunicazione neuronale e ritardando la maturazione delle giunzioni neuromuscolari. Una ridotta plasticità delle giunzioni neuromuscolari durante l’invecchiamento potrebbe quindi aumentare la vulnerabilità del sistema neuromuscolare a stress e lesioni, accelerandone la degenerazione.