Approcci Alternativi alla Sperimentazione Animale per Studiare l'Interferenza del Sistema degli Ormoni Tiroidei

This PhD project addressed the critical need for a more efficient and ethical approach to chemical safety assessment, aligning with the EU's Chemicals Strategy for Sustainability (CSS) and the requirement to reduce reliance on (vertebrate) animal-based testing and to identify the most harmful chemical substances. The research focused on advancing new approach methodologies (NAMs), specifically quantitative structure-activity relationship (QSAR) models, for evaluating chemicals able to disrupt the thyroid hormone (TH) system and consequently lead to a wide range of severe adverse effects, such as neurotoxicity. The central aim was the development of novel QSAR models to predict the ability of chemical substances to bind to human transthyretin (hTTR), a key molecular initiating event (MIE) in adverse outcome pathways (AOPs) for TH system disruption. This involved creating the largest, most comprehensive dataset of hTTR binding values collected and consolidated from the literature at that time, leading to the development of three new robust, in vitro assay-specific regression QSAR models. Furthermore, dedicated models were developed for per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), including a classification QSAR to first identify potential hTTR disruptors and a regression QSAR to quantify their T4-hTTR competing potencies. Overall, a strong focus was placed on the mechanistic interpretation of the selected molecular descriptors. A comprehensive review of existing QSAR models for TH system disruption was performed to define the state-of-the-art. This foundational objective was dedicated to QSAR models predicting relevant MIEs to meet the needs of integrating NAMs within the AOP framework for TH system disruption assessment. The analysis systematically identified knowledge gaps, providing a clear foundation for future research priorities. Crucially, the new QSARs were implemented into the open-access QSAR-ME Profiler software to facilitate their use, promoting transparency, and providing robust quantification of predictions uncertainty beyond the traditional definition of the applicability domain (AD). The practical utility of the models developed in this thesis was demonstrated by screening high-priority emerging contaminants, such as PFAS and pharmaceutical and personal care products (PPCPs), successfully filling data gaps and enabling the prioritisation of potentially hazardous compounds. The scope of the present project was also broadened to directly support the regulatory adoption of NAMs in the EU, including the assessment of feasibility for replacing in vivo acute fish toxicity testing (OECD TG 203) with NAMs for aquatic hazard of neurotoxicants, thereby actively promoting the transition away from animal testing. This thesis demonstrated that integrating scientifically rigorous, transparent, and mechanistic QSARs within the AOP framework is vital for supporting the transition toward a toxic-free environment and regulatory adoption of NAMs for TH system disruption assessment.

In questo progetto di tesi è stata affrontata l’importante necessità di un approccio più efficiente ed etico per la valutazione della sicurezza delle sostanze chimiche, in linea con la Strategia per la Sostenibilità delle Sostanze Chimiche (CSS) dell'Unione Europea e con il requisito di ridurre la dipendenza dai test basati sull'uso di animali (vertebrati) e di identificare le sostanze chimiche più nocive. La ricerca si è concentrata sul progresso delle metodologie di nuovo approccio (new approach methodologies, NAMs), in particolare i modelli basati sulla relazione quantitativa struttura-attività (QSAR), per la valutazione delle sostanze chimiche in grado di alterare il sistema degli ormoni tiroidei (TH) e, di conseguenza, di causare una vasta gamma di gravi effetti avversi, come la neurotossicità. L'obiettivo centrale è stato lo sviluppo di nuovi modelli QSAR per predire la capacità delle sostanze chimiche di legarsi alla transtiretina umana (hTTR), un evento molecolare iniziale (molecular initiating event, MIE) chiave nei percorsi di esito avverso (adverse outcome pathway, AOPs) per l'alterazione del sistema degli ormoni tiroidei. Ciò ha comportato la creazione del più ampio e completo dataset contenente valori di legame con la hTTR mai raccolto e consolidato dalla letteratura scientifica in quel momento, portando allo sviluppo di tre nuovi e robusti modelli QSAR di regressione specifici per in vitro assay. Inoltre, sono stati sviluppati modelli dedicati per le sostanze per- e polifluoroalchiliche (PFAS), tra cui un QSAR di classificazione per identificare le sostanze in grado di legare con la hTTR e un QSAR di regressione per quantificare la loro capacità di competizione con la T4 per legarsi alla hTTR. Nel complesso, è stata posta grande enfasi sull'interpretazione meccanicistica dei descrittori molecolari selezionati. È stata eseguita una revisione completa dei modelli QSAR esistenti per l'alterazione del sistema degli ormoni tiroidei al fine di definire lo stato dell'arte. Questo obiettivo fondamentale è stato dedicato ai modelli QSAR che predicono i MIE rilevanti, con il fine di soddisfare l'esigenza di integrare le NAMs all'interno del quadro AOP per la valutazione dell'alterazione del sistema degli ormoni tiroidei. L'analisi ha identificato sistematicamente le lacune esistenti, fornendo una chiara base per le future priorità di ricerca. In modo cruciale, i nuovi QSAR sono stati implementati nel software open-source QSAR-ME Profiler per facilitarne l'uso, promuovere la trasparenza e fornire una solida quantificazione dell'incertezza delle predizioni che va oltre la definizione tradizionale del dominio di applicabilità (AD). L'utilità pratica dei modelli sviluppati in questa tesi è stata dimostrata mediante lo screening di contaminanti emergenti, come i PFAS e i prodotti farmaceutici e per la cura personale (PPCPs), colmando con successo le lacune nei dati esistenti e consentendo la prioritizzazione dei composti chimici potenzialmente pericolosi. Lo scopo del presente progetto è stato inoltre ampliato per supportare direttamente l'adozione delle NAMs nel contesto regolatorio nell’UE, includendo la valutazione della fattibilità di sostituire i test in vivo di tossicità acuta sui pesci (linea guida OECD TG 203) con le NAMs per la valutazione del rischio acquatico di sostanze neurotossiche, promuovendo attivamente la transizione dall'uso di test su animali. Questa tesi ha dimostrato che l'integrazione di QSAR scientificamente rigorosi, trasparenti e meccanicistici all'interno del quadro AOP è fondamentale per sostenere la transizione verso un ambiente privo di sostanze tossiche e l'adozione delle NAMs nel contesto regolatorio per la valutazione dell'alterazione del sistema TH.