Un atlante digitale 4D dell’ovario di topo dalla nascita all’età adulta e durante l’invecchiamento

The World Health Organization (WHO) defines infertility as a disease affecting approximately 15-20% of couples, with female factors accounting for more than one-third of cases. Expanding our knowledge of the ovary, folliculogenesis, and oocyte maturation is therefore crucial for developing effective infertility treatments. In particular, there is a growing need to investigate ovarian structure and dynamics in a three-dimensional (3D) context, overcoming the limitations of traditional two-dimensional analyses. A 3D approach enables a more comprehensive understanding of the complex processes governing follicle maturation. Within this framework, this thesis aims to optimise a multimodal pipeline for the generation of a 4D digital atlas of the mouse ovary, describing morphological and functional changes from birth to adulthood and throughout ageing, and integrating these data into comprehensive 3D reconstructions. Fixed and paraffin-embedded ovaries were analysed using nano-Computed Tomography (nanoCT), an X-ray imaging technique enabling isotropic 3D reconstructions at high resolution (0.85-0.25 μm/pixel). This approach allowed the identification of all follicle stages, from primordial T1 to preovulatory T8, as well as corpora lutea. Morphological markers of follicular atresia were also detected, including zona pellucida remnants (ZPRs). NanoCT enabled quantification and spatial localisation of follicles from T3 to T8 and assessment of their viability. Analysis of the 3D volumes revealed a quantitatively symmetric distribution of follicles by developmental stage and atretic status, suggesting homogeneous regulation of recruitment and growth dynamics. This symmetry was established during the prepubertal period and maintained throughout adulthood and ageing, despite the age-related decline in follicle numbers. Importantly, nanoCT is a non-destructive technique, preserving tissue integrity for subsequent analyses. Accordingly, a protocol for sectioning and staining was optimised for confocal microscopy to visualise oocyte chromatin organisation, a parameter associated with transcriptional activity. Co-registration techniques enabled integration of oocyte spatial distribution and chromatin states into the 3D reconstructions, linking them to physiological conditions such as growth, atresia, and maturation. This approach, validated in 25 days post birth ovaries, supports its extension to other ages for 4D atlas completion. Quantitative data derived from nanoCT also enabled a mathematical approach to describe folliculogenesis. Specifically, this process, from 19 days to 4 months of age, was modelled as a finite-state machine, with the goal of estimating transition rates between follicle stages. This model provided insight into the mathematical rules underlying the maintenance of ovarian symmetry. The estimated transition rates, when analysed across anatomical sectors, suggested a link between follicle growth, elimination, and the preservation of spatial symmetry. Manual analysis of nanoCT datasets required substantial effort for follicle classification, annotation, and localisation, highlighting the need for automated methods. For this reason, the final part of this thesis presents preliminary proof-of-concept results for the development of a deep learning model capable not only of segmenting follicles but also of classifying them into their respective types. In conclusion, this thesis presents a multimodal pipeline for the construction of a 4D digital morpho-functional atlas of the mouse ovary. Its application has provided new and detailed insights into the evolution of folliculogenesis across the lifespan. Furthermore, this approach opens the possibility of extending functional analyses to all investigated ages to complete the atlas, applying it to ovarian pathological conditions, and adapting it to other species.

L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) definisce l’infertilità come una patologia che colpisce circa il 15-20% delle coppie, con fattori femminili responsabili di oltre un terzo dei casi. Ampliare le conoscenze sull’ovario, sulla follicologenesi e sulla maturazione degli oociti è quindi cruciale per lo sviluppo di trattamenti efficaci. In particolare, è sempre più necessario studiare la struttura e le dinamiche ovariche in un contesto tridimensionale (3D), superando i limiti delle tradizionali analisi bidimensionali, al fine di comprendere i complessi processi che regolano la maturazione follicolare. In questo contesto, la presente tesi si propone di ottimizzare una pipeline multimodale per la generazione di un atlante digitale 4D dell’ovario di topo, descrivendo i cambiamenti morfologici e funzionali dalla nascita all’età adulta e durante l’invecchiamento, e integrandoli in ricostruzioni 3D dell’organo. Ovari fissati e inclusi in paraffina sono stati analizzati mediante nano-Tomografia Computerizzata (nanoCT), una tecnica di imaging a raggi X che consente ricostruzioni 3D isotropiche ad alta risoluzione (0,85-0,25 μm/pixel). Questo approccio ha permesso di identificare tutti gli stadi follicolari, dal T1 primordiale al T8 preovulatorio, i corpi lutei e marcatori morfologici di atresia follicolare, inclusi i zona pellucida remnants (ZPRs). La nanoCT ha inoltre consentito la quantificazione, la localizzazione spaziale e la valutazione della vitalità dei follicoli dal T3 al T8. L’analisi dei volumi 3D ha rivelato una distribuzione quantitativamente simmetrica dei follicoli in base allo stadio di sviluppo e allo stato atretico, suggerendo un’omogenea regolazione dei processi di reclutamento e crescita. Tale simmetria si instaura in età prepuberale e viene mantenuta durante l’età adulta e l’invecchiamento, nonostante la riduzione del numero di follicoli associata all’età. La nanoCT è una tecnica non distruttiva, che preserva l’integrità tissutale per analisi successive. A questo scopo, è stato ottimizzato un protocollo di sezionamento e colorazione per la microscopia confocale, al fine di visualizzare l’organizzazione della cromatina degli oociti, un parametro associato all’attività trascrizionale. Tecniche di co-registrazione hanno permesso di integrare la distribuzione spaziale degli oociti e i loro stati cromatinici nelle ricostruzioni 3D, associandoli a condizioni fisiologiche quali crescita, atresia e maturazione funzionale. L’approccio, validato in ovari di 25 giorni di età, è estendibile alle altre età studiate per il completamento dell’atlante 4D. I dati quantitativi ottenuti mediante nanoCT hanno inoltre consentito un approccio matematico alla descrizione della follicologenesi. In particolare, il processo dai 19 giorni ai 4 mesi di età è stato modellizzato come una finite-state machine per stimare i tassi di transizione tra gli stadi follicolari. Questo modello ha permesso di individuare regole matematiche alla base del mantenimento della simmetria ovarica. I tassi di transizione stimati, analizzati per settori anatomici, hanno suggerito l’esistenza di un legame tra le dinamiche di crescita ed eliminazione follicolare e la conservazione della simmetria spaziale. Considerando l’elevato impegno richiesto dall’analisi manuale dei dataset nanoCT, la parte finale della tesi presenta risultati preliminari di proof-of-concept per la realizzazione di un modello di deep learning in grado di segmentare i follicoli e di classificarli nelle diverse tipologie. In conclusione, questa tesi propone una pipeline multimodale per la costruzione di un atlante digitale morfo-funzionale 4D dell’ovario di topo, fornendo nuove informazioni sull’evoluzione della follicologenesi lungo l’arco della vita e aprendo la possibilità di applicazioni a condizioni patologiche e ad altre specie.