Approcci Personalizzati alle Malattie del Fegato: Sviluppo di Nuovi Strumenti di Ricerca

Liver diseases constitute a heterogeneous group of disorders for which reliable preclinical models remain limited. To overcome the challenges associated with invasive sampling, cellular instability, and low translational relevance of conventional approaches, this thesis establishes human and murine platforms for disease modelling. A two – dimensional (2D) human system was developed using donor – derived urinary proximal tubular epithelial cells (PTEC) reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSC), while a three – dimensional (3D) murine hepatic organoid (Hep – Orgs) model was optimized. Together, these platforms combine donor specificity with experimental standardization, enabling both personalized and generalizable insights into liver pathophysiology. An optimized protocol for PTEC isolation and culture was first established, revealing that donor – related variables, including gender, urinary pH, and sample composition, significantly influenced adhesion and colony formation. Refinements such as phosphate buffer stabilization, selective filtration of female samples, and optimized storage conditions increased overall PTEC yield and reproducibility. Subsequently, PTEC were successfully reprogrammed into iPSC, although variability in reprogramming efficiency and residual factor expression highlighted the need for improved, factor – free systems. Differentiation into hepatocyte – like cells (HLCs) using multiple protocols demonstrated feasibility but also underscored persistent heterogeneity and incomplete maturation. Development of murine hepatic organoids (Hep – Orgs) provided a robust 3D model that maintained tissue architecture and long – term stability, bridging the gap between monolayer culture and in vivo physiology. Overall, this work presents a proof of concept for generating donor – derived, urinary iPSC – based liver disease models and introduces an organoid platform to enhance translational relevance. The dual – system approach advance the field of personalized hepatology by identifying critical determinants of reproducibility and by using human and murine models for mechanistic and therapeutic studies of liver disorders.

Le malattie epatiche costituiscono un gruppo eterogeneo di patologie per le quali i modelli preclinici affidabili risultano ancora limitati. Per superare le problematiche legate al campionamento invasivo, all’instabilità cellulare e alla scarsa rilevanza traslazionale degli approcci convenzionali, questa tesi sviluppa piattaforme umane e murine per il modellamento della malattia. È stato implementato un sistema umano bidimensionale (2D) basato su cellule epiteliali tubulari prossimali urinarie (PTEC) derivate da donatori e riprogrammate in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), mentre è stato anche ottimizzato un modello tridimensionale (3D) di organoidi epatici murini (Hep - Orgs). Queste piattaforme integrano la specificità del donatore con la standardizzazione sperimentale, consentendo di ottenere informazioni personalizzate e al tempo stesso generalizzabili sulla fisiopatologia epatica. È stato in primo luogo definito un protocollo ottimizzato per l’isolamento e la coltura delle PTEC, dimostrando che variabili legate al donatore – tra cui sesso, pH urinario e composizione del campione – influenzano significativamente l’adesione e la formazione di colonie. Raffinamenti tecnici, come la stabilizzazione con tampone fosfato, la filtrazione selettiva dei campioni femminili e condizioni di conservazione migliorate, hanno incrementato la resa e la riproducibilità dell’ottenimento delle PTEC. Successivamente, le PTEC sono state riprogrammate con successo in iPSC, sebbene la variabilità nell’efficienza e l’espressione residua dei fattori di riprogrammazione abbiano evidenziato la necessità di sistemi migliorati e privi di fattori esogeni. La differenziazione in cellule simili agli epatociti (HLCs), attraverso differenti protocolli, ha confermato la fattibilità dell’approccio, pur evidenziando un’eterogeneità persistente e una maturazione incompleta. Lo sviluppo degli organoidi epatici murini (Hep – Orgs) ha fornito infine un modello 3D robusto, capace di mantenere un’architettura tissutale fisiologicamente più fedele e stabilità a lungo termine, colmando il divario tra colture in monostrato e fisiologia in vivo. Nel complesso, questo lavoro rappresenta una proof of concept per la generazione di modelli di malattia epatica basati su iPSC urinarie derivate da donatore, e introduce una piattaforma 3D per aumentare la rilevanza traslazionale. Il duplice approccio contribuisce all’avanzamento dell’epatologia personalizzata identificando determinanti critici della riproducibilità e sfruttando modelli umani e murini per studi meccanicistici e terapeutici sulle patologie epatiche.