Virus-host interplay in SARS-CoV-2 infection: gaining insights into innate immune responses induced by variants of concern and mechanisms of immunopathogenesis using a human peripheral blood mononuclear cell-based in vitro model

Il SARS-CoV-2 è un nuovo betacoronavirus emerso alla fine del 2019, responsabile della pandemia COVID-19. Grazie alla sua elevata plasticità mutazionale, SARS-CoV-2 ha dato origine a numerose VOC, ciascuna caratterizzata da differenti efficienze replicative e proprietà di modulazione immunitaria. La gravità della malattia è strettamente legata alla risposta immunitaria dell’ospite all’infezione; pertanto, chiarire i meccanismi che collegano il riconoscimento virale all’attivazione dell’immunità innata è fondamentale per identificare e caratterizzare le risposte aberranti indotte dal virus. Gli obiettivi di questo progetto di dottorato sono stati: (1) indagare la risposta immunitaria innata alle VOC di SARS-CoV-2 (Alpha, Beta, Gamma, Delta e Omicron, incluse le sottovarianti di Omicron), utilizzando un modello in vitro basato su cellule PBMC, con particolare attenzione al rilascio di citochine pro-infiammatorie e antivirali; (2) identificare firme immunitarie innate specifiche per variante mediante un’analisi multi-omica a singola cellula del compartimento immunitario innato in seguito a stimolazione con SARS-CoV-2 BA.1. Il rilascio di citochine e chemochine è stato quantificato tramite multiplex bead array nei surnatanti di PBMC raccolti a 24 ore dalla stimolazione. È stata osservata una forte produzione di IFN-α dopo l’esposizione alle varianti D614G e Alpha, mentre Beta, Gamma e Delta non hanno indotto IFN-I, suggerendo l’acquisizione di strategie di evasione immunitaria differenti. La variante Omicron BA.1 ha invece indotto una robusta produzione di IFN-α, IL-6 e TNF-α, accompagnata da un aumento del rilascio di IL-8 e Rantes, mentre Beta si è confermata il più debole induttore di citochine e chemochine. L’analisi è stata successivamente estesa alla variante ricombinante post-Omicron XBB.1, confrontata con BA.1. La stimolazione con BA.1 ha determinato livelli più elevati di IL-6, mentre XBB.1 ha indotto una risposta più intensa in IFN-α ed è risultata l’unica in grado di stimolare la produzione di IL-12p70, una citochina non osservata con nessun’altra variante testata. Il profilo citofluorimetrico del compartimento immunitario innato ha evidenziato differenze funzionali tra le due varianti: XBB.1 ha promosso la maturazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi e convenzionali verso fenotipi più antivirali e ha potenziato l’attivazione dei linfociti T CD8⁺, mentre BA.1 ha ridotto la frequenza dei monociti infiammatori CD14lowCD16high, che invece aumentano in seguito all’esposizione a XBB.1. Per analizzare questi meccanismi con maggiore risoluzione, è stata applicata una profilazione integrata trascrittomica e proteomica a singola cellula su PBMC arricchite in HLA-DR stimolate con Omicron BA.1. L’esposizione virale ha indotto un profondo rimodellamento della fisiologia monocitaria, influenzando lo stato di differenziazione, l’espressione di molecole di adesione e la capacità di presentazione dell’antigene. I geni differentemente espressi (tra cui CD16, CD11b, CD86 e CD29) sono stati validati in donatori indipendenti sia a livello trascrizionale che proteico, confermandone il ruolo funzionale. La mappatura dell’RNA virale tra i sottotipi del compartimento innato ha rivelato un accumulo preferenziale nei monociti CD14⁺ e CD16⁺. Nei monociti positivi al virus, i programmi trascrizionali legati a risposte allo stress, infiammazione, riprogrammazione metabolica e segnalazione di citochine/chemochine risultavano up-regolati, mentre le vie di segnalazione dell’IFN- α/β e di presentazione dell’antigene erano represse. Analisi mediante PCR quantitativa e citofluorimetria intracellulare per la rilevazione di dsRNA hanno dimostrato che BA.1 replica transitoriamente in un sottoinsieme di monociti senza raggiungere un’infezione produttiva, modulando selettivamente geni che influenzano il fenotipo e la differenziazione monocitaria. Nel complesso, questi risultati indicano che le diverse VOC di SARS-CoV-2 modulano in modo distinto le vie intracellulari dell’ospite per regolare le risposte infiammatorie e antivirali delle cellule immunitarie innate. I dati multi-omici a singola cellula rivelano che SARS-CoV-2 colpisce specificamente i monociti per riprogrammare l’immunità dell’ospite, fornendo una chiave di lettura meccanicistica su come l’evoluzione virale plasmi l’interazione tra evasione immunitaria e pressione dell’immunità innata.