VINCRISTINE NEUROPATHY IN PEDIATRIC ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA: IN VITRO STUDIES WITH PATIENT SPECIFIC MODELS BASED ON INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS

Vincristine (VCR) is a key component of chemotherapy treatment in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL). This thesis focuses on developing personalized strategies for understanding and managing VCR-induced peripheral neuropathy (VIPN). To date, no universally effective treatment or proven preventive strategy exists for VIPN management. Patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) were generated by reprogramming the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 10 pediatric ALL long-term survivors who had been treated according to the AIEOP protocols. All of them were off therapy and in complete remission at enrollment. They included 5 cases (i.e., patients who developed VIPN during therapy) and 5 matched controls. PBMCs were reprogrammed into iPSCs via Sendai virus mediated transduction that introduces the Yamanaka's transcription factors. Reprogramming efficiency was limited and only 4 transductions were successful, leading to the generation of iPSCs of 4 individuals. Clones that displayed best embryonic-stem cell like morphology were selected for further expansion (n=3 per patient). To characterize the generated iPSC lines, qPCR analysis and immunofluorescence staining were performed. iPSC lines showed high gene expression levels of NANOG, OCT4, and SOX2, and c-MYC compared to PBMC. Immunofluorescence confirmed the endogenous nuclear expression of stemness markers OCT4 and SOX2. Finally, to assess differentiation potential, ALL-derived iPSC lines were successfully differentiated into ectodermal, mesodermal, and endodermal lineages using the StemMACS Trilineage Differentiation Kit, showing significantly increased expression of lineage-specific markers. Taken together, our findings validated the establishment of iPSC lines derived from ALL-survivors, as a first step toward building patient-specific neuronal models of VIPN. The STEMdiff™ Motor Neuron Differentiation Kit (Stem Cell Technologies) was used to differentiate patient’s and BJ-iPSCs into motoneurons (MN). qPCR assay confirmed the downregulation of stemness marker OCT4, and the expression of pan neuronal markers MAP2A, β-Tubulin III, of MN marker HB9 and cholinergic markers SLC18A3 and CHAT. On day 29, the protein expression of these genes was also confirmed by immunofluorescence. Preliminary whole-cell patch-clamp recordings revealed functional differences between untreated and BJ-derived MNs treated for 24 hours with VCR (3nM). VCR-treated MNs retained electrical activity, their firing patterns appeared altered, indicating an impairment in normal excitability mechanisms. Calcium (Ca2+) imaging was performed on case 4- MN at day 29 using Fluo-4 AM. MNs displayed an increase in intracellular Ca2+ fluxes after excitatory stimuli, as measured by the increase in ΔF/F₀. However, peak amplitude in treated MN was lower than in untreated ones and soon decreased over time. RNA‑sequencing in both BJ-MNs and Case 3 MNs revealed transcriptional changes following VCR exposure. Out of 37,728 genes discovered in BJ-MNs, 944 were significantly up-regulated whereas 1,027 were down-regulated; similarly, Case 3 MNs showed significant gene expression alterations, with 1,180 genes up-regulated and 719 genes down-regulated (FDR p-value < 0.05, Fold change 2). Altogether, these findings suggest that VCR causes molecular remodeling in MNs, affecting a broad range of genes and metabolic pathways. Additional in‑depth investigation will be necessary. Finally, a multicentric cohort of 237 pediatric ALL patients were genotyped for selected candidate polymorphisms involved in the VCR pharmacodynamics and pharmacokinetics by using TaqMan®SNP genotyping assays. Logistic regression model didn’t find any significant genetic contribution on grade 4 VIPN. Future analyses could be repeated by including less severe toxicity episodes.

La vincristina (VCR) è un farmaco chiave del trattamento nei pazienti pediatrici affetti da leucemia linfoblastica acuta (LLA). Questa tesi si concentra sullo sviluppo di strategie personalizzate per la comprensione e la gestione della neuropatia periferica indotta da vincristina (VIPN). Ad oggi, non esiste un trattamento efficace o una strategia preventiva per la gestione della VIPN. Sono state generate cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) riprogrammando, mediante trasduzione del Sendai virus, cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di 10 individui pediatrici sopravvissuti alla LLA, trattati secondo i protocolli AIEOP. 5 individui erano i “casi” ovvero pazienti che avevano sviluppato VIPN e 5 i “controlli”. L’efficienza della riprogrammazione è stata limitata, e solo 4 trasduzioni hanno avuto successo, portando alla generazione di iPSC di 4 individui. I cloni che mostravano la morfologia più simile a quella delle cellule staminali embrionali sono stati selezionati per un'ulteriore espansione. Sono state eseguite analisi di espressione genica e di immunofluorescenza (IF) per caratterizzare le iPSC. Le linee iPSC hanno mostrato dei livelli di espressione di marcatori di staminalità NANOG, OCT4 e SOX2, e c-MYC più elevati rispetto ai PBMC. IF ha confermato l'espressione proteica di OCT4 e SOX2 confermandone anche la localizzazione a livello nucleare. Infine, per valutarne la pluripotenza, le IPSC sono state differenziate in cellule ectodermiche, mesodermiche ed endodermiche utilizzando il kit StemMACS Trilineage Differentiation (Miltenyi Biotec), e valutando l’espressione genica di marker specifici dei tre foglietti embrionali. Nel complesso, i nostri risultati hanno convalidato la creazione di iPSC derivate da pazienti sopravvissuti alla LLA pediatrica, come primo passo verso la creazione di modelli neuronali specifici utili allo studio della VIPN. Il kit di STEMdiff™ (STEM CELL TECHNOLOGIES) è stato utilizzato per differenziare le iPSC derivanti dai pazienti e da un controllo sano (BJ-iPSC) in motoneuroni (MN). L’espressione genica ha confermato la downregulation di OCT4 e l'espressione di MAP2A, β-tubulina III, del marcatore dei MN HB9 e dei marcatori colinergici SLC18A3 e CHAT. L’analisi di immunofluorescenza ha confermato la differenziazione. Analisi elettrofisiologiche di patch-clamp sui MN derivati da BJ hanno dimostrato che i MN trattati con VCR (3nM) per 24 ore presentano pattern di attivazione alterati, indicando una compromissione dei normali meccanismi di eccitabilità. Sono stati analizzati, in via preliminare, i flussi di calcio in risposta agli stimoli eccitatori sui MN del caso 4 al giorno 29. I MN hanno mostrato un aumento dei flussi intracellulari di Ca2+, misurato dall'aumento di ΔF/F₀. Tuttavia, l'ampiezza di picco della risposta nei MN trattati era inferiore rispetto a quelli non trattati. Infine, un’analisi esplorativa di RNAseq sui MN derivanti dalle BJ e dal caso 3 ha rivelato sostanziali cambiamenti trascrizionali a seguito dell'esposizione alla VCR. Su 37.728 geni analizzati, 944 erano upregolati e 1.027 erano downregolati nei MN derivanti dalle BJ mentre 1.180 geni erano upregolati e 719 geni downregolati nei MN derivanti dal caso 3 (FDR p-value < 0.05, Fold change 2). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che la VCR causa un rimodellamento molecolare nei neuroni neuronali. Sarà necessario condurre ulteriori indagini approfondite. Infine, una coorte multicentrica di 237 pazienti LLA pediatrici è stata genotipizzata per alcuni polimorfismi candidati coinvolti nella farmacodinamica della VCR e nella farmacocinetica utilizzando le sonde TaqMan®. Il modello di regressione logistica non ha rilevato alcun contributo genetico sulla VIPN di grado 4. Analisi future potrebbero essere ripetute includendo episodi meno severi di tossicità.