STUDY OF TRIM18/MID1 UBIQUITIN LIGASE IN THE CONTROL OF PROTEIN HOMEOSTASIS

TRIM proteins represent a family of E3 ubiquitin ligases, mediators of the transfer of ubiquitin from an E2 enzyme to the target protein, promoting its ubiquitination. These proteins have gained significant attention due to their involvement in various diseases and cellular processes. In this project, our TRIM model is TRIM18/MID1, which is primarily associated with a genetic disorder called Opitz G/BBB Syndrome, a rare genetic disease characterized by developmental midline abnormalities and intellectual disabilities. The aim of my project is to investigate the behavior of MID1/TRIM18 upon cellular stress conditions to understand how different stimuli can affect the localization, the ability to be part of RiboNucleoProtein complexes (RNPs), and the activity of this E3 ubiquitin ligase investigating the wild type form as well as single residue and domain-specific mutant forms. Different studies showed that TRIM proteins are part of RiboNucleoProtein complexes (RNP) for their capacity of binding specific RNA sequences and structures. Based on these evidences and preliminary results in our lab, the aim of this study is the understanding of how TRIM18/MID1 ubiquitin ligase regulates localized protein synthesis and degradation through the formation of RNPs and non-membrane-bound biocondensates. In my work, I showed that the MID1/TRIM18 specific intracellular localization, i.e. associated with the microtubules, can be affected by pathological mutation. In the specific case, I found that a point mutation in the catalytic RING domain of the protein, found in an XLOS patient, that change the Cysteine in the position 56 to an Arginine, has a strong impact in the localization of MID1. Moreover, with the aim of understanding if the dynamic localization of MID1 can change in relation with the physiological state of the cell, we tried to induce different cellular stress conditions to demonstrate that MID1 intracellular localization can be affected by different external stimuli. By this screening, we found that Sodium Arsenite and Puromycin cause the detachment of MID1/TRIM18 from the microtubules. In particular, stressing cells with sodium arsenite led to the aggregation of MID1 in cytoplasmic bodies, comparable in size and dynamic speed to the canonical stress granules but without being part of the canonical ones. After puromycin treatment instead, the protein detaches from the microtubules and diffuses in the cytoplasm. All these experiments were carry on using the wild type form of MID1 but also the above-described pathological mutation, and an artificial mutant that lacks the entire catalytic RING domain, to understand if impairing the activity of the protein can also change the response of the protein to the stressors. These data will further increase our knowledge on the role of the MID1 protein and possibly on the pathological impact of its XLOS-mutated forms.

Le proteine TRIM rappresentano una famiglia di E3 ubiquitina ligasi, mediatori del trasferimento dell’ubiquitina da un enzima E2 alla proteina bersaglio, promuovendone l’ubiquitinazione. Queste proteine hanno attirato notevole interesse per il loro coinvolgimento in numerose patologie e processi cellulari. In questo progetto, il nostro modello di studio è TRIM18/MID1, principalmente associato a un disordine genetico noto come sindrome di Opitz G/BBB, una rara malattia genetica caratterizzata da anomalie dello sviluppo della linea mediana e disabilità intellettiva. L’obiettivo di questo progetto è investigare il comportamento di MID1/TRIM18 in condizioni di stress cellulare, al fine di comprendere come differenti stimoli possano influenzarne la localizzazione, la capacità di far parte di complessi ribonucleoproteici (RiboNucleoProtein complexes, RNPs) e l’attività di questa E3 ubiquitina ligasi, analizzando sia la forma wild-type sia varianti mutanti a singolo residuo o mutanti di delezione. Diversi studi hanno dimostrato che le proteine TRIM sono componenti di complessi ribonucleoproteici, grazie alla loro capacità di legare specifiche sequenze e strutture di RNA. Sulla base di queste evidenze e di risultati preliminari ottenuti nel nostro laboratorio, lo scopo di questo studio è comprendere come TRIM18/MID1 regoli la sintesi e la degradazione proteica localizzata attraverso la formazione di complessi RNP e biocondensati non delimitati da membrana. Nel mio lavoro ho dimostrato che la specifica localizzazione intracellulare di MID1/TRIM18, associata ai microtubuli, può essere alterata da mutazioni patologiche. In particolare, ho osservato che una mutazione puntiforme nel dominio catalitico RING della proteina, identificata in un paziente affetto da XLOS, che comporta la sostituzione della cisteina in posizione 56 con un’arginina, ha un forte impatto sulla localizzazione di MID1. Inoltre, con l’obiettivo di comprendere se la localizzazione dinamica di MID1 possa variare in relazione allo stato fisiologico della cellula, sono state indotte diverse condizioni di stress cellulare per dimostrare che la localizzazione intracellulare di MID1 può essere influenzata da differenti stimoli esterni. Attraverso questo screening, abbiamo osservato che l’arsenito di sodio e la puromicina causano il distacco di MID1/TRIM18 dai microtubuli. In particolare, il trattamento con arsenito di sodio induce l’aggregazione di MID1 in corpi citoplasmatici, comparabili per dimensioni e dinamica ai granuli di stress canonici, pur non facendone parte. Al contrario, dopo trattamento con puromicina, la proteina si distacca dai microtubuli e diffonde nel citoplasma. Tutti questi esperimenti sono stati condotti utilizzando sia la forma wild-type di MID1 sia la mutazione patologica sopra descritta, oltre a un mutante artificiale privo dell’intero dominio catalitico RING, al fine di comprendere se l’alterazione dell’attività della proteina possa modificare anche la risposta agli stressori. Questi dati contribuiranno ad ampliare la nostra conoscenza sul ruolo della proteina MID1 e, potenzialmente, sull’impatto patologico delle sue forme mutate associate alla XLOS.