INVESTIGATION OF THE ADAPTIVE MECHANISMS TO OCEAN ACIDIFICATION IN PATELLA SPECIES FROM CO2 VENT SYSTEMS OF THE MEDITERRANEAN SEA

ABSTRACT The continuous increase in anthropogenic carbon dioxide (CO2) emissions into the atmosphere is one of the main factors contributing to ocean acidification (OA). In fact, CO2 is partially absorbed by the oceans, where it alters carbonate chemistry and seawater pH, which is expected to decrease from the current level of 8.1 to 7.7 by 2100. OA exerts harmful impacts primarily on calcifying organisms, as it affects the availability of carbonates, which makes their calcareous structures thinner and more fragile. Moreover, several studies have described the detrimental effects of OA across many marine taxa, affecting important physiological and metabolic mechanisms. On the other hand, research conducted at CO2 vent systems, which are volcanic naturally acidified sites, showed that several organisms can survive under acidified conditions through specific tolerance and/or adaptive strategies. Among these organisms, the gastropod Patella spp. is one of the few calcifiers capable of inhabiting naturally acidified sites, such as the Castello Aragonese vent systems at Ischia Island and the San Giorgio vent systems at Sicily Island. Nonetheless, the complex mechanisms that allow survival and potential adaptation of these organisms to natural OA conditions need to be understood. Therefore, this PhD study aimed at investigating the potential molecular, physiological, metabolic, genetic, and epigenetic mechanisms that enable these organisms to tolerate and survive under OA conditions through a stepwise approach. Specifically, this PhD research attempted to answer the following questions: • Does OA entail a stressful condition in resident populations of Patella spp. living at reduced pH conditions, thereby affecting their overall well-being and health status? • Are there specific physiological, metabolic, and biochemical mechanisms that contribute in defining tolerance to OA? • Are limpets genetically adapted to OA? • Is DNA methylation contributing to promote tolerance to OA in limpets? • What is the role of environmental conditions in shaping the response to OA? The first chapter of this thesis considered three Patella species (P. caerulea, P. rustica, and P. ulyssiponensis) collected from the CO2 vent systems of the Castello Aragonese (Ischia Island). This vent system exhibits a natural acidification gradient ranging from ambient pH (N1: pH = 8.1), to intermediate pH (N2: pH = 7.7), and to extremely low pH (N3: pH < 7.4). Resident populations were collected along the gradient and at San Pietro, an additional ambient pH site (pH = 8.1), located at a distance of 4 km from the Castello vent. In addition, a 30-day in situ transplant experiment was conducted using P. caerulea, in order to evaluate the short-term responses induced by OA. Morphometric traits, such as shell length, height, width, and soft-tissue weight, were measured, and a set of biomarkers related to antioxidant system, energy metabolism, neurotoxicity, and biomineralization was applied. For resident populations, P. caerulea showed increased size and energy reserves at the extremely acidified site, likely related to a shift from erect calcified algae to biofilm, or to reduced competition and/or predatory pressure under acidified conditions. Biochemical endpoints measured in both P. caerulea and P. ulyssiponensis were not modified by OA. Conversely, P. rustica exhibited significant modulation of nearly all biochemical parameters, likely due to its different position on the rocky shore, which makes this species more exposed to tidal fluctuations and therefore to an additional source of disturbance, besides OA. Short-term exposure of P. caerulea to OA resulted in a decrease in protein content and an increase in glycogen content at the extremely acidified site, with the induction of superoxide dismutase and glutathione-S-transferase activities at intermediate pH, suggesting the activation of compensatory mechanisms to cope with reduced pH conditions. Overall, results revealed a distinct response to OA of the three species of Patella. Moreover, the increased size and energy-related endpoints observed in P. caerulea and P. rustica highlighted the need to further investigate energy metabolism aspects, in order to better understand the trade-offs between compensatory mechanisms and the energetic cost underlying tolerance to OA. Based on these evidences, the second chapter focused exclusively on P. caerulea, with the aim of deeply investigating metabolic and physiological stress-responses, comparing resident populations of the Castello Aragonese vent systems and transplanted organisms, similarly to the first chapter. Respiration and ammonia excretion rates were measured four times across the year. Additionally, untargeted metabolomics analyses were performed to investigate metabolic pathways potentially involved in response to OA. Only during summer, OA increased respiration rate in limpets from the most acidified site, while simultaneously reduced excretion rates, likely to allocate more energy resources to face the increasing temperature, besides OA. Furthermore, both resident and transplanted populations up-regulated carnitine metabolism, suggesting that OA induced an increase of energy production through β-oxidation and subsequent Krebs cycles. Moreover, several metabolites involved in osmoregulation, oxidative stress, and nucleic acid mechanisms were increased. Overall, results seem to confirm the presence of negative effects and of an energetic cost underpinning tolerance to OA. The third and final chapter investigated the potential influence of phenotypic plasticity, genetic adaptation, and DNA methylation in tolerance to OA in adult and juvenile populations of P. caerulea collected from two CO2 vent systems of the Mediterranean Sea. Adult and juvenile specimens were sampled along the acidification gradient of the Castello Aragonese vent systems of Ischia Island (San Pietro/N1: pH = 8.1; N2: pH = 7.7; N3: pH < 7.4) and from the San Giorgio vent systems of Sicily Island (Patti: pH = 8.1; San Giorgio: pH = 7.8). Following genomic DNA extractions from foot tissue and individual libraries preparation with the NEB Next® Enzymatic Methyl-seq Kit, samples were sequenced on the Illumina NovaSeq 6000 sequencer. Data processing and analyses were conducted on Euler platform mainly using biscuit tool, which enabled to simultaneously extract genomic and epigenomic information from DNA methylation sequencing. Population genomics and epigenomics analyses revealed divergent patterns between the Ischia and Sicily populations. Populations from the Ischia vent revealed marked signs of genomic differentiation, particularly in adults from the intermediate and extremely low pH sites, while reduced differences in DNA methylation levels were detected, especially in adults. These findings suggest a strong signature of purifying selection acting on standing genetic variation, through a within-generation response, likely driven by the more pronounced pH fluctuations occurring at these sites. Conversely, no genomic differentiation was observed between the Sicily populations, but greater differences in DNA methylation were detected between acidified and non-acidified sites at both adult and juvenile stages. These results revealed that this epigenetic mechanism, rather than genomic changes, may play a key role in the response to the milder pH variations of this vent and potentially enhance organisms’ tolerance to OA. In conclusion, this PhD project investigated tolerance to OA in limpets through a holistic approach that, for the first time, integrated morphological, physiological, metabolic, biochemical, genetic, and epigenetic analyses. Overall, findings revealed that Patella spp. has the ability to survive under acidified conditions even though with a physiological and metabolic cost, which could be partially compensated by more favorable environmental conditions. This study further highlights the importance of conducting research in naturally acidified environments, since it allows to formulate more realistic hypotheses about the ability of marine organisms to persist in future changing oceans.

RIASSUNTO Il continuo incremento delle emissioni antropogeniche di anidride carbonica (CO2) in atmosfera è uno dei principali fattori che contribuiscono all’acidificazione degli oceani (OA). Infatti, circa il 30% della CO2 emessa viene assorbita dagli oceani, dove ne altera l’equilibrio chimico e il pH, il quale è destinato a diminuire dall’attuale valore di 8,1 a circa 7,7 entro la fine del secolo (2100). Numerosi studi hanno evidenziato gli effetti negativi della riduzione del pH su molteplici taxa marini, con importanti ripercussioni a livello fisiologico e metabolico. In particolar modo, però, l’OA impatta negativamente gli organismi calcificanti, poiché influisce sulla disponibilità dei carbonati, rendendo le loro strutture calcaree più sottili e fragili. Ricerche condotte presso i sistemi di vent di CO2, che sono siti naturalmente acidificati dalla CO2 di origine vulcanica che fuoriesce dal fondale marino, hanno dimostrato che alcuni organismi sono in grado di sopravvivere in condizioni di acidificazione, potenzialmente grazie allo sviluppo di specifiche strategie di tolleranza e/o adattamento. Tra questi organismi, il gasteropode Patella spp. è uno dei pochi calcificanti capaci di sopravvivere in siti naturalmente acidificati, come i vent del Castello Aragonese a Ischia e quelli di San Giorgio in Sicilia. Tuttavia, i complessi meccanismi che consentono la sopravvivenza e il potenziale adattamento di questi organismi alle condizioni naturali di OA devono essere ancora chiariti. Pertanto, l’obiettivo di questo progetto di dottorato è stato quello di indagare i potenziali meccanismi molecolari, fisiologici, metabolici, genetici ed epigenetici che permettono a Patella spp. di sopravvivere e di tollerare condizioni di OA attraverso un approccio multidisciplinare. In particolare, questo progetto di dottorato ha cercato di rispondere alle seguenti domande: • L’OA comporta una condizione di stress nelle popolazioni di Patella spp. residenti nel vent del Castello Aragonese, tale da compromettere la loro condizione di salute e il loro benessere? • Esistono specifici meccanismi biochimici, fisiologici e metabolici che contribuiscono a determinare la tolleranza di Patella spp. all’OA? • Patella caerulea è geneticamente adattata all’OA? • C’è un coinvolgimento della metilazione del DNA nel promuovere la tolleranza all’OA? • Qual è il ruolo delle condizioni ambientali nel modellare la risposta all’OA? Il primo capitolo della tesi ha coinvolto tre specie di Patella (P. caerulea, P. rustica e P. ulyssiponensis) campionate presso i sistemi di vent di CO₂ del Castello Aragonese dell’Isola di Ischia. Questo vent è caratterizzato da un gradiente naturale di acidificazione che presenta siti con condizioni che variano da pH ambiente (N1: pH = 8,1), a pH intermedio (N2: pH = 7,7), fino a pH estremamente basso (N3: pH < 7,4). Le popolazioni residenti sono state campionate lungo il gradiente di acidificazione e presso il promontorio di San Pietro, un ulteriore sito a pH ambiente (pH = 8,1), localizzato a circa 4 km di distanza dall’area del vent. Inoltre, è stato condotto un esperimento di trapianto in situ della durata di 30 giorni utilizzando P. caerulea, con lo scopo di valutare le risposte indotte dall’acidificazione nel breve termine. Sono stati misurati tratti morfometrici, quali lunghezza, larghezza, altezza della conchiglia e peso dei tessuti molli, ed è stata applicata una batteria di biomarker relativi al sistema antiossidante, al metabolismo energetico, alla neurotossicità e alla biomineralizzazione. Nelle popolazioni residenti, P. caerulea ha mostrato un incremento significativo delle dimensioni e delle riserve energetiche nei siti acidificati, potenzialmente associato a una ridotta competizione e/o pressione predatoria, o a variazioni nella composizione della copertura algale, caratterizzata da uno shift da alghe erette calcificanti a biofilm, più appetibile per grazer come Patella. A differenza di P. caerulea e P. ulyssiponensis, solo P. rustica ha mostrato una modulazione significativa della maggior parte dei parametri biochimici analizzati, probabilmente a causa della sua diversa posizione sulla parete rocciosa, che la espone maggiormente alle fluttuazioni di marea e quindi a un’ulteriore fonte di disturbo. Infine l’esposizione a breve termine di P. caerulea all’OA ha determinato una diminuzione del contenuto proteico e un aumento del contenuto di glicogeno nel sito estremamente acidificato, con l’induzione delle attività della superossido dismutasi e della glutatione-S-transferasi a pH intermedio, suggerendo quindi l’attivazione di meccanismi compensatori per far fronte alle condizioni di acidificazione marina naturale. Nel complesso, i risultati hanno rivelato una risposta distinta all’OA nelle tre specie di Patella. In particolare, l’aumento delle dimensioni e dei parametri energetici osservato in P. caerulea e P. rustica ha evidenziato la necessità di approfondire gli aspetti legati al metabolismo energetico, con lo scopo di poter meglio comprendere il trade-off tra l’attivazione dei meccanismi compensatori e il costo energetico alla base della tolleranza all’OA. Sulla base di queste evidenze, il secondo capitolo si è focalizzato esclusivamente sulla specie P. caerulea, con l’obiettivo di indagare più dettagliatamente le risposte fisiologiche e metaboliche all’acidificazione marina, confrontando popolazioni residenti nei sistemi di vent del Castello Aragonese e organismi trapiantati, analogamente al primo capitolo. Per questo motivo, sono stati misurati i tassi di respirazione e di escrezione dell’ammoniaca quattro volte durante l’anno. Inoltre, sono state effettuate analisi di metabolomica untargeted per indagare i potenziali pathway metabolici coinvolti nella risposta all’OA. Solo durante la stagione estiva, l’OA ha aumentato il tasso respiratorio in individui di P. caerulea provenienti dal sito più acidificato, riducendo contemporaneamente i tassi di escrezione, potenzialmente per preservare maggiori risorse energetiche al fine di contrastare non solo l’OA, ma anche l’aumento delle temperature che caratterizza questa stagione. Inoltre, sia le popolazioni residenti sia quelle trapiantate hanno mostrato una sovraregolazione del metabolismo della carnitina, suggerendo quindi un’induzione della produzione di energia attraverso la β-ossidazione e i successivi cicli di Krebs. Inoltre, diversi metaboliti coinvolti nell’osmoregolazione, nello stress ossidativo e nei meccanismi legati agli acidi nucleici, sono risultati aumentati. Nel complesso, i risultati sembrano confermare la presenza di effetti negativi e di un costo energetico alla base della tolleranza all’OA. Il terzo e ultimo capitolo ha indagato la potenziale influenza della plasticità fenotipica, dell’adattamento genetico e della metilazione del DNA nella tolleranza all’OA in popolazioni adulte e giovanili di P. caerulea provenienti da due sistemi di vent di CO2 del Mar Mediterraneo. Adulti e giovanili di P. caerulea sono stati campionati lungo il gradiente di acidificazione dei sistemi di vent del Castello Aragonese (Ischia) (San Pietro/N1: pH = 8,1; N2: pH = 7,7; N3: pH < 7,4) e dai sistemi di vent di San Giorgio (Sicilia) (Patti: pH = 8,1; San Giorgio: pH = 7,8). In seguito all’estrazione del DNA genomico dal tessuto del piede e alla preparazione delle librerie individuali con il kit NEB Next® Enzymatic Methyl-seq, i campioni sono stati sequenziati mediante sequenziatore Illumina NovaSeq 6000. Il processamento e l’analisi dei dati sono stati condotti sulla piattaforma Euler utilizzando il tool biscuit, il quale ha consentito di estrarre simultaneamente informazioni genomiche ed epigenomiche da dati di sequenziamento della metilazione del DNA. Le analisi di genomica ed epigenomica hanno rivelato pattern divergenti tra le popolazioni di Ischia e della Sicilia. Le popolazioni provenienti dai vent di Ischia hanno mostrato marcati segni di differenziazione genomica, in particolare negli individui adulti provenienti dei siti a pH intermedio ed estremamente acido, mentre sono stati rilevati ridotti livelli di metilazione del DNA, in particolare allo stadio adulto. Questi risultati suggeriscono la presenza di una selezione purificante che agisce sulla variabilità genetica esistente, potenzialmente guidata dalle più pronunciate fluttuazioni di pH che caratterizzano i vent di Ischia. Al contrario, non è stata osservata alcuna differenziazione genomica tra le popolazioni del sistema di vent della Sicilia, ma sono state rilevate maggiori differenze nella metilazione del DNA tra siti acidificati e non acidificati sia negli stadi adulti che negli stadi giovanili. Questi risultati indicano quindi che questo meccanismo epigenetico può svolgere un ruolo chiave nella risposta alle variazioni di pH più moderate di questo sito e potenzialmente aumentare la tolleranza degli organismi all’OA. In conclusione, questo progetto di dottorato ha investigato i meccanismi di tolleranza all’acidificazione marina in diverse specie di Patella, attraverso un approccio olistico che, per la prima volta, ha integrato analisi morfologiche, fisiologiche, metaboliche, biochimiche, genetiche ed epigenetiche. Nel complesso, i risultati hanno evidenziato che Patella spp. è in grado di sopravvivere in condizioni acidificate, sebbene con un costo fisiologico e metabolico, il quale potrebbe essere parzialmente compensato dalle condizioni ambientali più favorevoli. Ciò sottolinea l’importanza di condurre ricerche in ambienti naturalmente acidificati, in quanto consente di formulare ipotesi più realistiche circa le capacità degli organismi marini di persistere ai cambiamenti climatici.