Physico-chemical characterization of DNA G-quadruplexes and their interaction with proteins and potential anticancer agents

Negli ultimi anni stato dimostrato che sequenze di DNA (o RNA) ricche in guanine sono in gradodi formare una nuova classe di strutture: le quadruple eliche. Importante e' la presenza di quadrupleeliche in regioni promotrici e regolatrici di molti geni e nella parte terminale dei cromosomi, itelomeri.Recentemente, lo studio di queste molecole ha avuto un notevole sviluppo grazie alle diverseapplicazioni che esse potrebbero avere in campo medico e farmaceutico. In particolare, le quadrupleeliche hanno una potenziale applicazione nella terapia anticancro quali inibitori della telomerasi, unenzima la cui iperattivit sicuramente collegata allo sviluppo del cancro. Un promettenteapproccio per inibire lattivit della telomerasi riguarda lutilizzo di agenti che possano legare estabilizzare le quadruple eliche presenti ai telomeri bloccando, in tal modo, lattivit catalitica dallatelomerasi ed agendo da antitumorali.Inoltre, stato scoperto che oligonucleotidi con struttura a quadrupla elica possono agire daaptameri, cio hanno la capacit di legare specificamente delle proteine bersaglio, inibendole.Laptamero denominato TBA (Thrombin Binding Aptamer) un oligomero a DNA con struttura aquadrupla elica, scoperto in vitro, che in grado di legare la trombina inibendone la funzione. IlTBA per le sue propriet anticoagulanti stato oggetto di numerosi studi sia di tipo strutturale sia dinatura farmacologica. Lattivit anticoagulante del TBA in vitro tale da giustificare un suoeventuale impiego in terapia, ma purtroppo tale attivit risulta piuttosto bassa in vivo poich il DNA rapidamente degradato dalle nucleasi.Uno degli obiettivi di questa tesi di dottorato stato quello di affrontare uno studio chimico-fisicodi composti che sono in grado di legarsi in maniera specifica alle quadruple eliche e dei fattori cheregolano gli equilibri in gioco; tali composti sono, infatti, in grado di incrementare la stabilit diquesti sistemi e di conseguenza ne possono aumentare leffetto terapeutico. Per questo motivo stata studiata la termodinamica dellinterazione di alcune molecole di interesse farmacologico, qualila distamicina, due suoi derivati e la porfirina cationica, con diverse quadruple eliche. Le quadrupleeliche prese in esame sono state la d[AG3(TTAG3)3] e la [d(TAGGGTTAGGG)]2 che rappresentanodue quadruple eliche formate da un diverso troncamento dal DNA telomerico umano e lad[(TGGGGT)]4 formata da una sequenza troncata del DNA telomerico di Oxytricha e Tetrahymena.Un altro obiettivo stato quello di caratterizzare la stabilit termodinamica del TBA e di unaptamero modificato (mTBA) ed il processo di binding di questi aptameri con la trombina.LmTBA presenta una modifica chimica in grado di rendere resistente laptamero allazione dellenucleasi che potrebbe rendere concreto un suo eventuale utilizzo come principio attivo di unfarmaco anticoagulante.Inoltre, stato anche affrontato uno studio computazionale di due quadruple eliche bimolecolariformate da sequenze analoghe di RNA e DNA allo scopo di chiarire i motivi per cui si formano duediverse strutture a quadrupla elica ed i fattori che le stabilizzano.Lo studio stata condotto principalmente attraverso tecniche calorimetriche quali la calorimetriaisoterma (ITC), la microcalorimetria differenziale a scansione (DSC), il dicroismo circolare (CD), emetodi computazionali quali meccanica e dinamica molecolare e docking.I risultati ottenuti per i sistemi quadrupla elica-ligando dimostrano che la distamicina ed un suoderivato contenente un anello metil pirrolico in pi ed un gruppo ammidico terminale, legano lequadruple eliche in esame, al contrario un secondo derivato della distamicina contenente due anellimetil pirrolici in pi ed un gruppo ammidico terminale non ha mostrato avere interazioni specifiche.I parametri termodinamici ottenuti indicano che le interazioni quadrupla elica-ligando sonofortemente influenzate dallo ione presente in soluzione e che anche la stechiometria di legame dipendente dal tipo di soluzione. Il calcolo dei parametri termodinamici ha mostrato che, sia insodio che in potassio, il legame della distamicina e del composto I alle quadruple eliche in esame entropicamente guidato. Questo dato in particolare suggerisce che il binding di queste molecolepotrebbe avvenire nei solchi delle quadruple eliche. Inoltre, un risultato particolarmente interessante che il composto I ha mostrato, in entrambe le soluzioni, una maggiore affinit della distamicinaper le quadruple eliche.I risultati ottenuti per linterazione porfirina-[d(TAGGGTTAGGG)]2 sono in generale accordo conla struttura cristallografica, recentemente riportata, del complesso ed indicano un bindingentalpicamente guidato con una stechiometria 2:1.Lo studio della stabilit termodinamica del TBA e del TBA modificato ha rivelato chelintroduzione della modifica aumenta sia la stabilit termica che termodinamica dellaptamero.Inoltre, i valori delle variazioni di entalpia ed entropia per la dissociazione del TBA modificatorisultano pi elevati rispetto al TBA, suggerendo una struttura pi rigida e la presenza di ulterioriinterazioni intramolecolari nellaptamero modificato. Questi risultati sono stati confermati edinterpretati sulla base dei risultati delle dinamiche molecolari dei due aptameri. I parametritermodinamici del processo di binding del TBA e del TBA modificato con la trombina mostranoche linterazione esotermica e che la stechiometria del complesso che si forma 1:2(aptamero:proteina). Il TBA modificato risulta per avere una pi alta affinit per la trombina e lasua interazione associata ad una variazione di entalpia maggiormente favorevole. I risultati delledinamiche molecolari dei complessi suggeriscono che la maggior affinit dellaptamero modificatosia dovuta essenzialmente ad una migliore interazione con lesosito II della trombina.Lo studio di dinamica molecolare delle quadruple eliche di RNA e DNA ha evidenziato che lamaggiore differenza tra le due molecole deriva dalla presenza del gruppo 2-OH del ribosio, checontribuisce considerevolmente al numero di legami idrogeno formando pi interazioniintramolecolari nella molecola di RNA. I legami che hanno una maggiore persistenza sono quelliformati con lossigeno del gruppo fosfato. Questo tipo di legame idrogeno conferisce rigidit allastruttura ed in parte responsabile della stabilit delle esadi presenti nella quadrupla elica di RNA.Inoltre, durante le simulazioni, gli ioni Na+, inizialmente non direttamente coordinati alle quadrupleeliche, vanno a coordinare in modo stabile le macromolecole indicando un possibile meccanismo dicoordinazione non ancora osservato sperimentalmente.Parte della ricerca stata svolta in collaborazione con la Prof. Concetta Giancola del Dipartimentodi Chimica dellUniversit Federico II di Napoli. Inoltre, una parte dello studio stato realizzato aLondra presso i laboratori del Prof. Stephen Neidle della School of Pharmacy dellUniversity ofLondon, e presso il gruppo della Dott. Franca Fraternali, della Randall Division del Kings CollegeLondon. [a cura dell'autore]