Design and structural optimization of new molecules as potential antiinflammatory and/or anticancer agents

Linfiammazione ed il cancro sono due complessi meccanismi patologici in cui risultano coinvolti una serie di differenti mediatori molecolari. La profonda connessione tra cancro ed infiammazione ben nota e la modulazione di questi processi rappresenta uno dei principali obiettivi della moderna chimica farmaceutica.Lidentificazione di nuove entit molecolari capaci di interferire con target biologici coinvolti in questi due meccanismi altamente auspicabile per lo sviluppo sia di nuovi potenziali farmaci sia di sonde molecolari utili per studiare aspetti biologici finora meno investigati. Tre principali target, coinvolti a vari livelli nellinfiammazione e nel cancro, sono stati investigati a fondo: le proteine contenenti bromodomain (BRD), lenzima microsomiale prostaglandina E2 sintasi di tipo 1 (mPGES-1) e lo chaperone heat shock protein 90 (Hsp90). I risultati ottenuti possono essere riassunti in tre principali sezioni, in base al target di interesse:a) Scoperta di nuovi modulatori dei bromodomain umani attraverso approcci structure-based e metodiche computazionali. I BRD sono moduli proteici evolutivamente conservati che fungono da readers del codice istonico, riconoscendo residui di acetil-lisina (Kac) sulle code istoniche. Il coinvolgimento delle proteine contenenti BRD recentemente emerso in molteplici patologie, specialmente in processi tumorali. Allo scopo di identificare un nuovo chemotipo in grado di mimare Kac, stato intrapreso un approccio structure-based partendo da frammenti a nucleo 9H-purinico. Uno dei frammenti inizialmente identificati (2a), che era emerso come ligando dei BRD umani, stato sistematicamente modificato impiegando approcci si sintesi organica in modo da ricavare un profilo di relazioni struttura attivit da sfruttare nel successivo step di ottimizzazione strutturale. Questi studi hanno permesso di individuare ligandi con affinit nellordine del nanomolare per BRD9 (composti 7d e 11) e solo residua affinit micromolare per BRD4. Il legame di 7d e 11 al bromodomain di BRD9 stato investigato mediante esperimenti di cristallografia e di docking flessibile che hanno evidenziato un esteso riarrangiamento dei residui aminoacidici che formano la tasca di riconoscimento di Kac, suggerendo un meccanismo di interazione di tipo induced-fit. Infine, i composti non hanno esibito alcun effetto citotossico in cellule HEK293T e hanno efficacemente spiazzato il bromodomain di BRD9 dalla cromatina in saggi BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), influendo solo parzialmente sul complesso BRD4/istone.b) Identificazione ed ottimizzazione strutturale di inibitori dellmPGES-1 a nucleo diidropirimidinico. LmPGES-1 un omotrimero di membrane coinvolto nella cascata dellacido arachidonico, che funge da enzima terminale nella via biosintetica delle cicloosigenasi (COX) catalizzando la formazione della prostaglandina (PG)E2 dal precursore PGH2. Linibizione dellmPGES-1 pu rappresentare un valido approccio terapeutico per modulare la formazione della PGE2 indotta da stimoli infiammatori, permettendo di evitare interferenze con i prostanoidi costitutivamente prodotti. Al fine di individuare una nuova piattaforma molecolare per la modulazione dellmPGES-1, stato seguito un approccio structure-based focalizzato su una collezione di molecole a nucleo 3,4-diidropirimidin-2(1H)-onico (DHPM), utilizzando la prima struttura cristallografica ad alta risoluzione dellenzima in forma attiva (PDB: 4AL0). Le interazioni con la controparte recettoriale sono state introdotte come filtro qualitativo per la selezioni dei composti pi promettenti da sintetizzare nella successiva fase di sintesi chimica. I risultati biologici ottenuti sono stati in accordo con i suggerimenti computazionali portando allindividuazione di due molecole (48 e 49) con una promettente attivit inibitoria nei confronti dellmPGES-1 da saggi in vitro. La pi recente struttura cristallografica dellmPGES-1 in complesso con linibitore noto LVJ (PDB: 4BPM) stata utilizzata per ottimizzare il composto 48 (IC50 = 4.16 0.47 M), portando al composto 53, un inibitore con attivit 10 volte maggiore rispetto al composto lead (IC50 = 0.41 0.02 M).Allo scopo di investigare ulteriormente questo complesso enzima, sono stati seguiti anche protocolli di espressione eterologa dellmPGES-1 umano, seguiti da successivi studi di cristallizzazione bidimensionale.c) Il nucleo diidropirimidinico come nuovo chemotipo per la modulazione del sito C-terminale di Hsp90. Hsp90 uno chaperone molecolare ampiamente coinvolto nello sviluppo, sopravvivenza e proliferazione di cellule tumorali. I pi noti inibitori di Hsp90 si legano alla regione N-terminale della proteina. Tuttavia, questo tipo di modulazione associato in ambito clinico a problemi di somministrazione e di tossicit dovuti allinduzione della risposta da stress nelle cellule tumorali, un meccanismo citoprotettivo indesiderato. Sebbene meno investigata, linibizione del sito C-terminale di Hsp90 rappresenta un approccio alternativo molto promettente per lo sviluppo di nuovi potenziali farmaci antitumorali, in quanto esso non risulta essere associato agli effetti negativi causati dalla risposta da stress. Nel tentativo di identificare modulatori della regione C-terminale di Hsp90 non ispirati a composti naturali, una collezione di derivati a nucleo diidropirimidinico(DHPM) stata sintetizzata. Il razionale alla base di tale scelta deriva dellanalogia strutturale tra tale scaffold e luridina trifosfato, un nucleotide capace di legarsi selettivamente al C-terminale di Hsp90, ma non allN-terminale. Saggi biologici hanno confermato che il nucleo diidropirimidinico pu essere effettivamente considerato come un nuovo chemotipo per la modulazione della funzione chaperonica di Hsp90 attraverso linterazione con la sua regione C-terminale. In particolare, il composto 54 stato identificato come un nuovo promettente agente antiproliferativo capace di legarsi al C-terminale di Hsp90. [a cura dell'autore]