BIOMEDICAL, IMMUNOLOGICALS AND EPIDEMIOLOGICAL STUDIES ON LEISHMANIA

Abstract of the thesis Leishmania tarentolae is a non-pathogenic protozoan parasite generally associated with reptiles, which has recently emerged as a versatile model in biothecnological and biomedical research. It is characterized by rapid growth rate, low maintenance cost, and can be handled under Biosafety Level 1 (BSL-1) conditions, making it a safe and accessible laboratory system. Despite being non-pathogenic, L. tarentolae retains molecular and biological features common to pathogenic Leishmania species, representing a relevant model for host–parasite interaction studies. L. tarentolae is increasingly used as a eukaryotic expression platform for the production of heterologous protein. Unlike Escherichia coli, it performs mammalian-like post-translational modifications, including glycosylation, while avoiding the hyper-mannosylation introduced by yeast systems, which may compromise protein folding and functionality for biomedical use. Compared with mammalian cell cultures, L. tarentolae o[ers lower operational costs, high scalability, and reduced biosafety constraints. These combined features reinforce its attractiveness as a cell factory for biotechnological and therapeutic applications. This PhD research investigates the technological, immunological and diagnostic potential of L. tarentolae through four major lines of investigation: • Development of a chemically defined medium for L. tarentolae growth, enabling its conformity with biomedical research guidelines; • Application of L. tarentolae as a mucosal delivery system for recombinant antigens, demonstrated with the experimental SARS-CoV-2 vaccine LeCoVax-2; • Exploitation of L. tarentolae as a mucosal vaccine vector, to explore its potential to elicit a specific immune response. • Evaluation of host–parasite interactions, focusing on primary canine macrophages cell line. In addition, considering the current limited knowledge on the distribution of Leishmania tarentolae, this thesis also investigates the epidemiology and diagnostic detection of this parasite in northern Italy. Particular attention is given to the possible involvement of sand fly Sergentomyia minuta, which is traditionally considered the vector of L. tarentolae and has previously tested positive for L. infantum DNA. Furthermore, L. tarentolae DNA detection in human and canine blood raises questions about the potential expansion of its host range. 6 Considering this, the thesis also examined the presence of Sauroleishmania in additional hosts, including fire salamanders and geckos, while focusing on the role of synanthropic reptiles. This investigation is particularly relevant considering that the close association of these hosts with human environments and domestic animals may facilitate the circulation of Leishmania parasites. Basing on this evidences, the research conducted in this thesis focuses also on: • The development of a highly sensitive method for simultaneous detection of the non- pathogenic L. tarentolae and the pathogenic L. infantum in sand flies and reptile blood samples. • A screening of L. tarentolae and L. infantum in synanthropic reptiles and in sand fly vectors in the northern Italy. • Investigation of the host range of Sauroleishmania species in non-traditional hosts, including fire salamanders and African geckos. The results obtained in these studies are presented in eight publications included in the thesis: Article 1: A novel chemically defined medium for the biotechnological and biomedical exploitation of the cell factory Leishmania tarentolae. [published in: Scientific Repors]. This study describes the development of a medium without animal supplementation for the cultivation of L. tarentolae cultures, enabling its applications in the biomedical field. The chemically-defined medium was also tested and validated on recombinant L. tarentolae clones, higliting its potential for the production of recombinant proteins and its exploitation as cell factory. Article 2: EQicacy of mucosal vaccination using a protozoan parasite as a vehicle for antigen delivery: IgG and neutralizing response after rectal administration of LeCoVax-2, a candidate vaccine against COVID-19. [published in: Pharmacological Research] This study investigates the potential of recombinant L. tarentolae clones as vehicle for mucosal vaccine delivery, exploiting an engineered L. tarentolae clone expressing a SARS-CoV-2 antigen. This article aims to explore the possibility of inducing systemic and mucosal immune reponses, including IgG and neutralizing anitbodies, through a rectal administration. This innovative strategy contributes to revealing the potential versatility of L. tarentolae platform. Article 3: Rectal Administration of Leishmania Cells Elicits a Specific, Th1-Associated IgG2a Response in Mice: New Perspectives for Mucosal Vaccination against leishmaniasis, after the Repurposing of a Study on an Anti-Viral Vaccine Candidate. [published in: Tropical Meidcin and Infectious Disease] This study investigates L. tarentolae as a mucosal vaccine vector against leishmaniasis via rectal administration in a murine model, demonstrating its ability to induce a robust Th1- oriented immune response, which is associated with protective immunity against Leishmania. These findings open new avenues for alternative vaccination routes. Article 4: Intracellular persistence of Leishmania tarentolae in primary canine macrophage cells. [published in: Acta Tropica] This study focused on the interaction between primary canine macrophages and L. tarentolae, exploring its intracellular behaviour, evaluating the possible cytopathic e[ects and the host immune response. The results indicate that L. tarentolae is non-pathogenicity and can persist intracellularly without inducing cytopathic e[ects, higliting its potential as a versatile platform for biomedical applications. Article 5: Development of a novel ddPCR assay for the simultaneous detection of the protozoan parasites Leishmania infantum and Leishmania tarentolae. [published in: Parasites&Vectors] This study describes the development of a digital droplet PCR (ddPCR) assay for the simoultaneous detection of the non-pathogenic L. tarentolae and the pathogenic L. infantum. This research aims to develope an highly sensitive and specific assay that can provide and higher accuracy in Leishmania diagnostics avoiding cross-reaction results. Article 6: Sand Fly Fauna and Prevalence of Leishmania spp. in a Newly Investigated Area of Northern Italy: Emerging Epidemiological Scenarios? [published in: Transboundaries and Emerging Diseases] This study investigates the circulation and distribution of L. tarentolae and L. infantum in Northern, focusing of sand flies and reptile blood samples. A ddPCR developed during the PhD period was employed to obtain a higly sensitive detection. This research evaluate also the potential role of synanthropic reptiles as reservoirs, and assess emerging epidemiological scenarios for Leishmania transmission. Articole 7: Beyond reptiles: the fire salamander as a potential host for Leishmania (Sauroleishmania) tarentolae [published in International Journal of Parasitology: Parasites and Wildlife] This study investigates the potential role of fire salamanders as hosts for Leishmania (Sauroleishmania) tarentolae, expanding the understanding of the parasite’s host range. The research evaluates the presence of the parasite in non-traditional hosts, considering the ecological implications for parasite circulation and transmission dynamics. Article 8: Unveiling Sauroleishmania in southern Africa: An investigation and supplementary description of Leishmania (Sauroleishmania) zuckermani from the gecko host Chondrodactylus bibronii [published in International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife] This study presents a work carried out during a three-months research period abroad at the University of Free State (Bloemfontein, South Africa), exploring the distribution and host associations of Sauroleishmania in African geckos. The research provides insights into the ecology and host specificity of Sauroleishmania species, highlighting potential new reptile hosts and contributing to the understanding of parasite circulation in non-European regions. In conclusion, the results presented in this thesis provide a comprehensive overview of L. tarentolae as both an emerging biotechnological tool and a parasite of epidemiological relevance. The study highlights the potential of L. tarentolae as a safe and scalable platform for recombinant protein production and mucosal vaccine delivery, while also exploring its immunomodulatory properties and host–parasite interactions in mammalian cells. 9 Furthermore, this thesis addressed the development of sensitive molecular tools for the simultaneous detection of L. tarentolae and L. infantum. Investigations on sand flies and synanthropic reptiles further contribute to understanding parasite circulation and potential transmission pathways in Northern Italy. Finally, studies on non-traditional hosts, including fire salamanders and African geckos, expand our knowledge of Sauroleishmania host range and distribution. Collectively, these studies underscore the dual significance of L. tarentolae as both a biotechnological resource and a topic of epidemiological interest.

Riassunto della tesi Leishmania tarentolae è un protozoo non patogeno generalmente associato ai rettili, recentemente emerso come modello versatile nella ricerca biotecnologica e biomedica. È caratterizzato da un rapido tasso di crescita, bassi costi di mantenimento e può essere manipolato in condizioni di Biosicurezza di Livello 1 (BSL-1), rendendolo un sistema laboratoristico sicuro e accessibile. Nonostante la non patogenicità, L. tarentolae conserva caratteristiche molecolari e biologiche comuni alle specie patogene di Leishmania, rappresentando un modello rilevante per lo studio delle interazioni ospite-parassita. L. tarentolae è sempre più utilizzata come piattaforma eucariotica per l’espressione di proteine eterologhe. A di[erenza di Escherichia coli, e[ettua modificazioni post-traduzionali di tipo mammifero, inclusa la glicosilazione, evitando l’iper-mannosilazione introdotta dai sistemi di lievito, che può compromettere il folding proteico e la funzionalità biomedica. Rispetto alle colture cellulari di mammifero, L. tarentolae o[re costi operativi ridotti, alta scalabilità e minori vincoli di biosicurezza. Queste caratteristiche combinate ne ra[orzano l’attrattiva come “cell factory” per applicazioni biotecnologiche e terapeutiche. Questa ricerca di dottorato indaga il potenziale tecnologico, immunologico e diagnostico di L. tarentolae attraverso quattro linee principali di indagine: • Sviluppo di un terreno chimicamente definito per la crescita di L. tarentolae, consentendo la conformità alle linee guida per la ricerca biomedica; • Applicazione di L. tarentolae come sistema di somministrazione mucosale di antigeni ricombinanti, dimostrato mediante il vaccino sperimentale SARS-CoV-2 LeCoVax-2; • Sfruttamento di L. tarentolae come vettore vaccinale mucosale, per esplorarne il potenziale nell’indurre una risposta immunitaria specifica; • Valutazione delle interazioni ospite–parassita, con particolare focus sulla linea cellulare di macrofagi primari canini. Inoltre, considerata la conoscenza ancora limitata sulla distribuzione di Leishmania tarentolae, questa tesi indaga anche l’epidemiologia e la rilevazione diagnostica del parassita nel Nord Italia. Particolare attenzione è rivolta al possibile coinvolgimento del flebotomo Sergentomyia minuta, tradizionalmente considerato vettore di L. tarentolae e risultata precedentemente positiva per DNA di L. infantum. Inoltre, la presenza di DNA di L. tarentolae rilevata in campioni di sangue umano e canino solleva interrogativi sull’eventuale ampliamento del suo range di ospiti. In questo contesto, la tesi ha esaminato anche la presenza di Sauroleishmania in ospiti aggiuntivi, tra cui salamandra pezzata e gechi, con particolare attenzione al ruolo dei rettili sinantropici. Tale indagine è particolarmente rilevante considerando che la stretta associazione di questi ospiti con ambienti antropizzati e animali domestici può facilitare la circolazione dei parassiti Leishmania. Sulla base di queste evidenze, la ricerca condotta in questa tesi si concentra anche su: • Lo sviluppo di un metodo altamente sensibile per la rilevazione simultanea della non patogenica L. tarentolae e della patogena L. infantum in campioni di flebotomi e sangue di rettili; • Uno screening di L. tarentolae e L. infantum in rettili sinantropici e flebotomi nel Nord Italia; • L’indagine sul range di ospiti delle specie Sauroleishmania in ospiti non tradizionali, tra cui salamandra pezzata e gechi africani. I risultati ottenuti in questi studi sono presentati in otto pubblicazioni incluse nella tesi: Articolo 1: A novel chemically defined medium for the biotechnological and biomedical exploitation of the cell factory Leishmania tarentolae. [pubblicato in: Scientific Reports] Questo studio descrive lo sviluppo di un terreno privo di supplementi animali per la coltivazione di L. tarentolae, consentendo le applicazioni nel campo biomedico. Il terreno chimicamente definito è stato testato e validato su cloni ricombinanti di L. tarentolae, evidenziandone il potenziale per la produzione di proteine ricombinanti e il suo impiego come cell factory. Articolo 2: EQicacy of mucosal vaccination using a protozoan parasite as a vehicle for antigen delivery: IgG and neutralizing response after rectal administration of LeCoVax-2, a candidate vaccine against COVID-1G. [pubblicato in: Pharmacological Research] Questo studio esplora il potenziale dei cloni ricombinanti di L. tarentolae come veicolo per la somministrazione mucosale di vaccini, utilizzando un clone ingegnerizzato che esprime un antigene SARS-CoV-2. L’articolo valuta la possibilità di indurre risposte immunitarie sistemiche e mucosali, incluse IgG e anticorpi neutralizzanti, mediante somministrazione rettale. Questa strategia innovativa evidenzia la versatilità della piattaforma L. tarentolae. Articolo 3: Rectal Administration of Leishmania Cells Elicits a Specific, Th1-Associated IgG2a Response in Mice: New Perspectives for Mucosal Vaccination against leishmaniasis, after the Repurposing of a Study on an Anti-Viral Vaccine Candidate. [pubblicato in: Tropical Medicine and Infectious Disease] Questo studio analizza L. tarentolae come vettore vaccinale mucosale contro la leishmaniosi in modello murino tramite somministrazione rettale, dimostrando la capacità di indurre una robusta risposta immunitaria orientata Th1, associata a immunità protettiva contro Leishmania. I risultati aprono nuove prospettive per vie alternative di vaccinazione. Articolo 4: Intracellular persistence of Leishmania tarentolae in primary canine macrophage cells. [pubblicato in: Acta Tropica] Questo studio si concentra sull’interazione tra macrofagi primari canini e L. tarentolae, esplorandone il comportamento intracellulare, valutando potenziali e[etti citopatici e la risposta immunitaria dell’ospite. I risultati indicano che L. tarentolae è non patogena e può persistere intracellularmente senza e[etti citopatici, evidenziandone il potenziale come piattaforma versatile per applicazioni biomediche. Articolo 5: Development of a novel ddPCR assay for the simultaneous detection of the protozoan parasites Leishmania infantum and Leishmania tarentolae. [pubblicato in: Parasites & Vectors] Questo studio descrive lo sviluppo di un saggio di digital droplet PCR (ddPCR) per la rilevazione simultanea della non patogenica L. tarentolae e della patogena L. infantum, con l’obiettivo di ottenere un test altamente sensibile e specifico, riducendo falsi positivi dovuti a cross- reattività. Articolo 6: Sand Fly Fauna and Prevalence of Leishmania spp. in a Newly Investigated Area of Northern Italy: Emerging Epidemiological Scenarios? [pubblicato in: Transboundary and Emerging Diseases] Questo studio indaga la circolazione e distribuzione di L. tarentolae e L. infantum nel Nord Italia, con focus su flebotomi e campioni di sangue di rettili. È stata impiegata la ddPCR 13 sviluppata durante il periodo di dottorato per una rilevazione altamente sensibile. La ricerca valuta il ruolo potenziale dei rettili sinantropici come serbatoi e propone scenari epidemiologici emergenti per la trasmissione di Leishmania. Articolo 7: Beyond reptiles: the fire salamander as a potential host for Leishmania (Sauroleishmania) tarentolae [pubblicato in: International Journal of Parasitology: Parasites and Wildlife] Questo studio esplora il ruolo potenziale della salamandra pezzata come ospite per L. (Sauroleishmania) tarentolae, ampliando la conoscenza riguardo gli range di ospiti del parassita. La ricerca valuta la presenza del parassita in ospiti non tradizionali, considerando le implicazioni ecologiche per la circolazione e la trasmissione del parassita. Articolo 8: Unveiling Sauroleishmania in southern Africa: An investigation and supplementary description of Leishmania (Sauroleishmania) zuckermani from the gecko host Chondrodactylus bibronii [pubblicato in: International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife] Questo studio presenta un lavoro condotto durante un periodo di ricerca di tre mesi presso la University of Free State (Bloemfontein, Sudafrica), esplorando distribuzione e associazioni ospite di Sauroleishmania in gechi africani. La ricerca fornisce approfondimenti sull’ecologia e la specificità degli ospiti delle specie di Sauroleishmania, evidenziando nuovi potenziali ospiti rettili e contribuendo alla comprensione della circolazione del parassita in aree non europee. In conclusione, i risultati presentati in questa tesi o[rono una panoramica completa su L. tarentolae come strumento biotecnologico emergente e parassita di rilevanza epidemiologica. Lo studio evidenzia il potenziale della piattaforma L. tarentolae come sistema sicuro e scalabile per la produzione di proteine ricombinanti e la somministrazione mucosale di vaccini, esplorandone anche le proprietà immunomodulatorie e le interazioni ospite-parassita in cellule di mammifero. Inoltre, la tesi ha a[rontato lo sviluppo di strumenti molecolari sensibili per la rilevazione simultanea di L. tarentolae e L. infantum. Le indagini su flebotomi e rettili sinantropici contribuiscono ulteriormente alla comprensione della circolazione del parassita e dei potenziali percorsi di trasmissione nel Nord Italia. Infine, gli studi su ospiti non tradizionali, 14 comprese salamandre di fuoco e gechi africani, ampliano le conoscenze sul range e sulla distribuzione degli ospiti di Sauroleishmania. Collettivamente, questi studi evidenziano la duplice rilevanza di L. tarentolae come risorsa biotecnologica e come oggetto di interesse epidemiologico.