Approcci di Deep Learning per l’Analisi di Immagini di Microscopia a Fluorescenza Confocale e l’Ottimizzazione dei Protocolli Sperimentali

Deep learning (DL) is a fundamental tool in modern data analysis that enables the automatic extraction of complex patterns from high-dimensional data. In biomedical imaging, DL methods are used to automate and enhance the interpretation of data, a task that can be extremely time consuming when done manually by an operator. In this work, I focused on confocal fluorescence microscopy, a technique that provides high-resolution, three-dimensional representations of cellular and subcellular structures. However, the analysis of confocal data often requires extensive preprocessing and segmentation of cells and subcellular organelles, a process that is difficult to automate due to variability in imaging conditions and experimental setups. In this thesis, I developed deep learning approaches that bypass the need for segmentation of individual fluorescent channels. Instead, the models were trained using weak labels corresponding to the overall assay outcome, enabling classification without pixel-level annotations. This strategy was applied to a biological assay involving monoclonal antibodies: the opsonophagocytosis assay (OPA). In the OPA, the analysis achieved accurate classification and further demonstrated that the experimental protocol could be optimised, showing that a single fluorescent channel was sufficient for correct classification instead of the four used in the original protocol. This finding led to a reduction in acquisition time and experimental costs. In a second line of work, conducted during an internship abroad, I investigated the application of DL for the analysis of highly multiplexed confocal images acquired using a novel imaging technology. Using SubCell, a foundation model for cellular and subcellular imaging analysis, I analyzed the learned representations (embeddings) of images obtained with this new acquisition method. This analysis provided an objective, data-driven assessment of the potential advantages and limitations of the new technology. Overall, this thesis demonstrates how deep learning can enhance confocal microscopy image analysis across diverse experimental contexts, improving efficiency, reducing costs, and supporting biologists in the interpretation and analysis of their data.

Il deep learning (DL) è uno strumento fondamentale nell’analisi moderna dei dati, in quanto consente l’estrazione automatica di pattern complessi da dati ad alta dimensionalità. Nell’ambito dell’imaging biomedico, i metodi di DL vengono impiegati per automatizzare e migliorare l’interpretazione dei dati, un processo che richiede un notevole impegno di tempo se svolto manualmente da un operatore. In questa tesi mi sono concentrata sulla microscopia a fluorescenza confocale, una tecnica che fornisce rappresentazioni tridimensionali ad alta risoluzione di strutture cellulari e subcellulari. L’analisi dei dati confocali però, richiede spesso un ampio pre-processing e la segmentazione di cellule e organelli subcellulari, un processo difficile da automatizzare a causa della variabilità delle condizioni di acquisizione e dei setup sperimentali. In questa tesi ho sviluppato approcci di deep learning che eliminano la necessità di segmentare i singoli canali fluorescenti. I modelli sono stati invece addestrati utilizzando etichette deboli (weak labels) corrispondenti all’esito complessivo del saggio, consentendo la classificazione senza annotazioni a livello di pixel. Questa strategia è stata applicata ad un saggio biologico che coinvolge anticorpi monoclonali: il saggio di opsonofagocitosi (OPA). Nell’OPA, l’analisi ha raggiunto una classificazione accurata e ha inoltre dimostrato che il protocollo sperimentale poteva essere ottimizzato, mostrando che un singolo canale fluorescente era sufficiente per una corretta classificazione, invece dei quattro utilizzati nel protocollo originale. Questo risultato ha portato a una riduzione dei tempi di acquisizione e dei costi sperimentali. In una seconda linea di ricerca, condotta durante un tirocinio all’estero, ho studiato l’applicazione del DL per l’analisi di immagini confocali altamente multiplexate acquisite mediante una nuova tecnologia di imaging. Utilizzando SubCell, un modello di base (foundation model) per l’analisi cellulare e subcellulare, ho analizzato le rappresentazioni apprese (embeddings) delle immagini ottenute con questo nuovo metodo di acquisizione. Tale analisi ha fornito una valutazione oggettiva e basata sui dati dei potenziali vantaggi e limiti della nuova tecnologia. Nel complesso, questa tesi dimostra come il deep learning possa migliorare l’analisi delle immagini di microscopia confocale in diversi contesti sperimentali, aumentando l’efficienza, riducendo i costi e supportando i biologi nell’interpretazione e nell’analisi dei loro dati.