Investigations and aetiological analyses on serious decline of olive trees in Apulia due to fungal microorganisms, and confusable with OQDS (Xylella fastidiosa)

Olive (Olea europaea L.) represents a key crop for the Mediterranean Basin, with a central economic, cultural and ecological role, particularly in southern Italy. Over the last two decades, olive groves in Apulia have been severely affected by a widespread decline phenomenon, initially attributed exclusively to Olive Quick Decline Syndrome (OQDS), associated with the bacterium Xylella fastidiosa subsp. pauca (Xfp). However, increasing field observations and early investigations suggested that additional biotic factors might be involved in disease expression and progression. This thesis, conducted as part of a four-year PhD program, aims at clarifying the contribution of fungal communities to olive decline in Apulia, their interaction with Xfp, and the influence of abiotic stressors on host–pathogen relationships. A large-scale survey was carried out between 2022 and 2024 across the region, and specifically in ten distinct areas, integrating systematic field sampling with culture-based isolations, molecular diagnostics and multi-locus phylogenetic analyses. Pathogenicity trials, including mono- and multifactorial experiments, were conducted to assess fungal virulence under non-stressed and stress-conditioned scenarios. Survey results revealed a high prevalence and frequent co-occurrence of Xfp with fungi belonging mainly to the Botryosphaeriaceae and Apiosporaceae families in symptomatic plants. Both fungal families could be considered important actors, even though Botryosphaeriaceae seem to be the major contributors in the symptoms overlapping with those of ODQS. These findings support the hypothesis of a complex and multifactorial disease system affecting olive trees in Apulia. Within the Botryosphaeriaceae, Diplodia seriata emerged as the most recurrent species across the surveyed areas, yet it behaved as a low-virulence pathogen under non-stressed conditions. Pathogenicity trials demonstrated that its pathogenic potential is strongly modulated by environmental factors, markedly increasing under water stress and, in particular, under combined water and thermal stress. In contrast, Neofusicoccum mediterraneum, although detected at a comparatively low frequency in the investigated areas, consistently proved to be the most virulent species in pathogenicity assays, inducing severe symptoms regardless of plant water status. Neofusicoccum stellenboschiana showed an intermediate virulence compared with the other Botryosphaeriaceae, while being widely distributed across the surveyed areas. This combination of recurrence and moderate pathogenicity suggests that its role in olive decline may be underestimated under non-stress conditions and deserves further investigation under abiotic stress scenarios. Metagenomic analyses, introduced and partially developed in this thesis, will provide an additional, unbiased insight into fungal community composition and recurrence, complementing traditional diagnostic approaches. In conclusion, this thesis provides novel insights into the olive pathosystem by elucidating the distribution and association of fungal communities with olive decline syndromes. The findings highlight the opportunistic nature of these micro-organisms, specifically their ability to undergo a pathogenic transition from an endophytic lifestyle to a virulent state when environmental stressors compromise the host’s immune system. Overall, this work supports a shift from a single-pathogen paradigm towards a multifactorial framework in which microbial interactions and environmental stress play a central role in olive decline in Mediterranean agroecosystems.

L’olivo (Olea europaea L.) rappresenta una coltura di rilevante importanza per il Bacino del Mediterraneo, con un ruolo centrale a livello economico, culturale ed ecologico, in particolare nel Sud Italia. Negli ultimi due decenni, gli oliveti della Puglia sono stati gravemente colpiti da un fenomeno di deperimento diffuso, inizialmente attribuito esclusivamente alla Sindrome del Deperimento Rapido dell’Olivo (OQDS), associata al batterio Xylella fastidiosa (Xf). Tuttavia, osservazioni sul campo e indagini preliminari sempre più dettagliate hanno suggerito che ulteriori fattori biotici possano contribuire all’espressione e alla progressione della malattia. Il presente lavoro di dottorato ha come obiettivo quello di chiarire il contributo dei microrganismi fungini al deperimento degli olivi in Puglia, la loro interazione con Xf e l’influenza di fattori abiotici sulle relazioni ospite–patogeno. Tra il 2022 e il 2024 è stata condotta un’ampia indagine a livello regionale, integrando campionamenti sistematici con isolamenti fungini, diagnostica molecolare e analisi filogenetiche multi-locus. Sono stati inoltre effettuati saggi di patogenicità, comprensivi di esperimenti mono- e multifattoriali, per valutare la virulenza dei funghi in condizioni di stress e non stress. I risultati delle indagini hanno evidenziato un’alta prevalenza e una frequente co-infezione di Xf con funghi appartenenti alle famiglie delle Botryosphaeriaceae e Apiosporaceae nelle piante sintomatiche, supportando l’ipotesi di un sistema patologico complesso e multifattoriale. All’interno delle Botryosphaeriaceae, Diplodia seriata si è rivelata la specie più ricorrente nelle aree indagate, sebbene si sia rilevata essere avirulenta in condizioni di piante ben irrigate. I saggi di patogenicità hanno dimostrato che il suo potenziale patogenico è fortemente modulato da fattori ambientali, aumentando in modo marcato quando le piante inoculate sono sotto stress idrico e, in particolare, sotto combinazione di stress idrico e termico. Al contrario, Neofusicoccum mediterraneum, sebbene rilevato con una frequenza relativamente bassa, si è confermato come la specie più virulenta nelle prove di patogenicità, inducendo sintomi gravi indipendentemente dallo stato idrico della pianta. Neofusicoccum stellenboschiana ha mostrato un livello di virulenza intermedio rispetto alle altre Botryosphaeriaceae, pur essendo ampiamente distribuito nelle aree indagate. Questa combinazione di ricorrenza e patogenicità moderata suggerisce che il suo ruolo nel deperimento dell’olivo potrebbe essere sottostimato e merita ulteriori approfondimenti in scenari con stress abiotici. Le analisi metagenomiche, introdotte e parzialmente sviluppate in questa tesi, forniranno una visione ulteriore e imparziale sulla composizione e la ricorrenza delle comunità fungine, integrando gli approcci diagnostici tradizionali. In conclusione, il presente lavoro di tesi offre nuovi elementi di comprensione del patosistema olivo, facendo luce sulla distribuzione delle comunità fungine e sulla loro associazione con le sindromi di deperimento. I risultati evidenziano la natura opportunistica di tali microrganismi, con particolare riferimento alla loro capacità di operare una transizione, passando da una fase endofitica latente a una virulenta, qualora gli stress ambientali indeboliscano le difese dell’ospite. Nel complesso, lo studio sostiene il superamento del paradigma del 'singolo patogeno' a favore di un approccio multifattoriale, in cui le interazioni microbiche e le variabili ambientali assumono un ruolo determinante nei deperimenti di olivo nell’ambiente mediterraneo.