Spettroscopia Vibrazionale di Interfacce Bio-funzionalizzate e Trasduttori a Grafene per la Rivelazione di Singole Molecole

Large-area bio-functionalized interfaces are fundamental for determining the sensitivity and selectivity of high-performance biosensors. Numerous biomarkers have been detected at the physical limit of a single-molecule into 100 µL of the assayed solution (corresponding to a concentration of ⁓10-20 M) using a sensing element that encompass a high density of bioreceptors, ⁓1012 cm-2, immobilized onto a solid substrate. Remarkably, the binding of a single or few analyte molecules to the bioreceptor layer triggers an extended surface potential variation across the sensing interface. This effect involves trillions of unbound molecules, in a domino-like cascade, producing a measurable signal that enables detection. The objective of this doctoral thesis is the study and the application of the bio-functionalized interfaces, with reference to those encompassing a monolayer of antibodies physisorbed onto a gold substrate, typical of immunosensors. A novel biosensing approach has been proposed, leveraging the capacitive coupling of a large-area interface bio-functionalized with Immunoglobulin M antibodies (anti-IgM), to a single-layer graphene transducer inspected through Raman spectroscopy. Proof-of-concept experiments demonstrated the detection of IgM antigens at concentration as low as 10-19 M. The inherent sensitivity of phonons in the bidimensional material enabled the signal transduction, revealed as a shift of the charge neutrality point of the graphene layer in response to the surface potential changes occurring at the sensing interface upon formation of few antibody-antigen immunocomplexes. The properties of the antibody layer have been investigated by means of polarization-modulation infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS). The prominent spectral features have been recorded with a high signal to noise ratio (> 100). The analysis of the amide bands, with particular attention to the deconvolution of the amide I band characteristic of proteins, provided insightful information about protein conformation at the level of their secondary structure. A method to examine the structural order of physisorbed layer of antibodies has been developed, based on the comparative analysis of PM-IRRAS spectroscopy and attenuated-total-reflection (ATR) spectroscopy measurements. Our findings demonstrate partial order within the biolayer, mainly involving the β-sheet domains of proteins. The sensing interface has been characterized via different methods, and PM-IRRAS spectroscopy represents a reliable means to directly inspect the biolayer at the molecular scale of the oscillating dipole moments. The densely packed layer of physisorbed antibodies appear to transition through different metastable states, under electrical and biological stimuli. These different configurations could alter the biolayer properties on different scales, from macroscopic features such as the water contact angle, to the structure of the overall protein dipole moments, involving charge rearrangements and inter- and intra- molecular forces. Within this framework, this doctoral thesis contributes to the study and to the understanding of the rich network of interactions across a layer of physisorbed of antibodies constrained in a non-physiological environment, offering new perspectives to enhance the performance of biomaterials for biosensing application.

Il ruolo delle macro-interfacce bio-funzionalizzate è fondamentale per ottenere sensitività e selettività elevate in biosensori per applicazioni nella diagnostica medica. La rivelazione di un gran numero di biomarcatori è stata dimostrata, con performance al limite fisico di rivelazione di una singola molecola in 100 µL di soluzione (⁓10-20 M), utilizzando interfacce di sensing costituite da uno strato di bio-recettori, ad alta densità ⁓1012 cm-2, immobilizzati su un substrato solido. Il legame di una singola, o poche molecole di analita sullo strato di riconoscimento scatena una variazione estesa del potenziale superficiale dell’interfaccia di sensing. Questa modifica coinvolge trilioni di molecole non legate, in un effetto domino a cascata, che produce un segnale misurabile. L’obiettivo di questa tesi di dottorato riguarda lo studio e l’applicazione di tali interfacce bio-funzionalizzate, focalizzandosi, in particolare, sull’analisi di strati biologici costituiti da anticorpi fisisorbiti su substrato d’oro, tipicamente impiegati in sensori immunometrici. Nella tesi è proposto un approccio innovativo per la rivelazione di proteine, basato sull’accoppiamento capacitivo tra una macro-interfaccia bio-funzionalizzata con anticorpi-Immunoglobuline M (anti-IgM), e un trasduttore a grafene, interrogato tramite spettroscopia Raman. Gli esperimenti riportati dimostrano preliminarmente il principio di funzionamento del biosensore, che è stato capace di rivelare antigeni-IgM fino a concentrazioni di 10-19 M. Inoltre, le proprietà dello strato di anticorpi fisisorbiti sono state investigate tramite spettroscopia di riflettività-assorbimento infrarosso con modulazione di polarizzazione (PM-IRRAS). La tecnica consente la misura dello spettro IR di film biologici, dallo spessore di ⁓10 nm, con un elevato rapporto segnale rumore (> 100). L’analisi delle bande originate dal legame peptidico nelle proteine, con particolare attenzione alla deconvoluzione della banda amide I, ha fornito informazioni rilevanti riguardo la conformazione degli anticorpi adsorbiti, al livello della loro struttura secondaria. Un metodo per indagare l’ordine strutturale delle molecole nello strato biologico è stato sviluppato, basato sull’analisi comparativa delle misure di spettroscopia PM-IRRAS e di spettroscopia a riflessione-totale-interna (ATR), che ha permesso di verificare un ordine parziale dei β-sheets delle proteine adsorbite. Lo strato di anticorpi fisisorbiti con elevata densità su substrato solido incorre in transizioni tra stati metastabili, indotti da stimoli di natura elettrostatica e biologica. La spettroscopia PM-IRRAS ha contribuito allo studio di tali stati con informazioni dirette sulle interazioni agenti su scala molecolare, a livello dei dipoli oscillanti. Questa tesi costituisce un supporto alla comprensione del complesso sistema costituito da molecole biologiche vincolate in un ambiente non fisiologico, offrendo prospettive per migliorare le prestazioni e l’integrazione di questi biomateriali in biosensori ultrasensibili.