Preservation, Characterization, and Bioremediation Potential of Microbiomes from PFAS-impacted Soil and Sediment

Poly- and perfluoroalkyl substances (PFASs) are persistent, bio accumulative, and toxic environmental pollutants that adversely affect ecosystems and human health. Traditional physicochemical approaches such as filtration and adsorption (e.g., activated carbon) commonly involve high costs, substantial energy inputs, and secondary environmental pollution, including the release of shorter-chain PFAS. Bioremediation is therefore increasingly explored as a promising and sustainable alternative. Several studies have evidenced that contaminants' transformation may be driven by community-level processes where inter-species interactions play a central role. However, most of the literature is focused on the study of isolated microbial strains on these contaminants and studies focusing on complex environmental microbiomes remain scarce, particularly when considering their functional dynamics. This reinforces the importance of studying natural microbiomes to understand their structural and functional dynamics. This study aimed to investigate the preservation, propagation, and utilization of environmental PFAS-impacted microbiomes for their potential exploitation in bioremediation protocols. Furthermore, to support this work, methodological standardization was addressed by developing and validating Standard Operating Procedures (SOPs) of sampling and DNA extraction. The interlaboratory validation revealed good reproducibility and consistency of the research units, and no significant differences in the microbial diversity, community structure, and taxonomic composition were found among the samples. For this study, soil (Soil) and sediment (Sed) matrices were obtained from two sites in the Vicenza Province (Veneto, Italy). These sites have been affected by PFAS contamination resulting from industrial wastewater release. Chemical analysis revealed that sediment was more contaminated (17,700 ng kg⁻¹) than soil (5,370 ng kg⁻¹), with a dominance of PFOS and PFSA in sediment, and PFOA in soil samples. Samples were cryopreserved (with 30% v/w glycerol) at -80 °C and preservation impacts were assessed at four time points: T0 (pre storage), T1 (3 months storage), T2 (8 months storage), and T3 (12 months storage). The effect of storage on microbiomes was analyzed through either culture-dependent or -independent methods such as total microbial counts, Biolog EcoPlate analysis, and DNA metabarcoding. These analyses were performed to study microbial viability, metabolic activity, and community structure shifts at DNA level during preservation. Results showed that bacterial counts were stable up to T2 (8 months) in both matrices followed by a decrease in viable counts at T3 (12 months) particularly in Soil. Fungi showed no change in viability during the preservation process in sediment, but a slight decrease was observed after 12 months in soil. Biolog analysis showed that soil had a higher initial metabolic activity than sediment, and a clear decrease in the number of substrates used mainly from T2 to T3, suggesting the loss of selected metabolic functions. In sediment, there was a gradual decrease in metabolic activities. DNA extraction from the environmental matrixes showed that sediment provided a substantially greater yield of total genomic DNA (15-30 µg g-1) than soil (3-7.5 µg g-1). Metabarcoding data revealed that sediment and soil-derived microbiomes evidenced with no correlation between microbial communities (both bacteria and fungi) and storage time. Bacterial communities were consistently dominated by Proteobacteria, Bacteroidota, and Actinobacteriota, while fungal communities were characterized by the high prevalence of Sordariomycetes, Agaricomycetes, and Leotiomycetes. Microbial propagation was performed by enrichment cultures adding PFOA (from 300 to 600 mg L⁻1) as sole source of carbon and energy across the preservation time points (T0, T1, T2 and T3), Genomic DNA was successfully extracted from all enrichment cultures, with higher DNA yields (0.58-1.82 µg ml-1) in sediment than from soil (0.29-0.59 µg ml-1). The microbial succession after PFOA enrichment revealed distinct banding patterns by DGGE analysis. In sediment, a similarity of about 20% was observed between T0 and T3. In soil, this temporal separation was even greater where similarity dropped to only 5% between T0 and T3. These findings evidenced a change in enriched community structure derived from microbiome stored at different timing, with a more pronounced shift in microbial structure in the soil derived cultures. The new microbiomes obtained from the different enrichment cultures were tested in batch abatement trials using PFOA (25 mg L⁻¹) and PFHxS (10 mg L⁻¹) as the reference compounds over 87 days. Total count revealed an increased bacterial count in soil and a stable count in sediment during the experiment. On the other hand, no significant abatement of PFAS was observed, suggesting no active biodegradation or transformation of PFAS under these conditions. A total of 158 bacterial (resolved into 103 bacterial operational taxonomic units) and 53 fungal strains were isolated. Different genera exhibited temporal changes, Pseudomonas, Flavobacterium, Microbacterium, Brucella, Brevundimonas, and Rhodanobacter being prominent bacterial groups. Galactomyces, Trichosporon, Candida, Geotrichum and Fusarium were prominent fungal groups throughout the different enrichment cultures, suggesting adaptation to stress conditions related to the presence of PFAS. Isolated strains were further characterized. Six isolates showed apparent growth on DM agar plates supplied with 50 mg L⁻¹ PFOA: Brevundimonas sp. 9T2SB, Chryseobacterium sp. 5T2LA, Sphingobacterium spp. (9T2LB, 5T3SA), Geotrichum sp. 3T2SA, and Candida sp. 4T2SB. When these selected isolates were subjected to biotransformation assays of a structurally varied range of PFAS (PFOA, PFOS, 8:2 FTS, GenX, 7:3 FTCA, and NFDHA) revealed no detectable fluoride (F-) release or transformation in both axenic cultures and consortia, indicating high recalcitrance of these compounds. In contrast, co-metabolic assays demonstrated the transformation of fluoxetine (FLX), with glucose serving as the primary substrate supporting microbial growth and metabolism. Thus, FLX transformation occurred through glucose-supported co-metabolism. HPLC and ion-selective electrode analysis confirmed substantial FLX removal and steady F- release, particularly by strains Brevundimonas sp. 9T2SB, Sphingobacterium sp. 5T3SA, and Candida sp. 4T2SB. This suggests that these strains, while lacking inherent pathways to mineralize PFAS, have active co-metabolic defluorination pathways to degrade less complex fluorinated aromatics. In summary, cryogenic preservation showed progressive changes in microbial vitality and functional activity over storage time, whereas core community structure in terms of DNA was maintained. Under PFAS exposure, neither enriched microbiomes nor isolated strains exhibited PFAS biotransformation or defluorination under the tested conditions. However, selected isolates transformed fluoxetine under co-metabolic conditions, with fluoride release, indicating potential for less recalcitrant fluorinated compounds. Overall, these results emphasize both the impact and the importance of preservation of PFAS-associated microbiomes and the inherent challenges of PFAS biodegradation, highlighting the need for further investigation into conditions that support effective transformation.

Le sostanze poli- e perfluoroalchiliche (PFAS) sono inquinanti ambientali persistenti, bioaccumulabili e tossici che compromettono gli ecosistemi e la salute umana. Gli approcci fisico-chimici tradizionali, come la filtrazione e l’adsorbimento (ad esempio mediante carbone attivo), comportano generalmente costi elevati, un significativo consumo energetico e possibili impatti ambientali secondari, inclusa la formazione di PFAS a catena più corta. Pertanto, la bioremediation può essere considerata un’alternativa promettente e sostenibile. Tuttavia, ad oggi, gran parte della letteratura si concentra sullo studio delle capacità di trasformazione di questi composti da parte di singoli ceppi isolati.La trasformazione dei contaminanti può invece essere guidata da processi a livello di comunità microbiche, in cui le interazioni interspecifiche svolgono un ruolo centrale. Il presente studio ha obiettivo di valutare la conservazione, la propagazione e il loro potenziale utilizzo in protocolli di biorisanamento di microbiomi presenti in matrici ambientali contaminate da PFAS—suolo (Soil) e sedimento (Sed)— A tal fine, campioni di suolo e sedimento sono stati raccolti in due siti nella provincia di Vicenza (Veneto, Italia), contaminati da PFAS a causa di scarichi industriali. Le analisi chimiche hanno evidenziato una maggiore contaminazione nei sedimenti (17.700 ng kg⁻¹) rispetto al suolo (5.370 ng kg⁻¹), con predominanza di PFOS e PFSA nei sedimenti e di PFOA nei campioni di suolo. I campioni sono stati crioconservati (con glicerolo al 30% v/p) a −80 °C e gli effetti della conservazione sono stati valutati a quattro tempi: T0 (prima della conservazione), T1 (3 mesi), T2 (8 mesi) e T3 (12 mesi). La conservazione dei microbiomi è stata valutata sia con metododiche coltura-dipendenti che indipendenti, tra cui conte microbiologiche totali, analisi Biolog EcoPlate e DNA metabarcoding. I risultati hanno mostrato che le conte batteriche sono rimaste stabili fino a T2 (8 mesi) in entrambe le matrici, seguite da una diminuzione della vitalità a T3 (12 mesi), particolarmente nel suolo. I funghi non hanno mostrato variazioni significative nella vitalità nei sedimenti, mentre nel suolo è stata osservata una lieve riduzione dopo 12 mesi. L’analisi Biolog ha evidenziato una maggiore attività metabolica iniziale nel suolo rispetto al sedimento e una chiara diminuzione del numero di substrati utilizzati, soprattutto tra T2 e T3, suggerendo la perdita di specifiche funzioni metaboliche. Nei sedimenti, invece, si è osservata una diminuzione più graduale dell’attività metabolica. L’estrazione del DNA ha mostrato rese significativamente più elevate nei sedimenti (15–30 µg g⁻¹) rispetto al suolo (3–7,5 µg g⁻¹). I dati di DNA metabarcoding effettuati sia sulla popolazione batterica che fungina hanno evidenziato che le comunità microbiche presenti nel sedimento e suolo non evidenziavano una significativa correlazione con il tempo di stoccaggio. Le comunità batteriche erano dominate da Proteobacteria, Bacteroidota e Actinobacteriota, mentre quelle fungine erano caratterizzate principalmente da Sordariomycetes, Agaricomycetes e Leotiomycetes. L propagazione microbica delle matrici conservate è stata condotta tramite colture di arricchimento utilizzando PFOA (ad una concentrazione crescente da 300 a 600 mg L⁻¹) come unica fonte di carbonio ed energia. Lo scopo principale era valutare e confrontare l’arricchimetomicrobico derivante dai campioni durante i diversi tempi di conservazione e per favorire l’isolamento di ceppi tolleranti al PFOA. Il DNA genomico è stato estratto con successo da tutte le colture di arricchimento, con rese più elevate nei sedimenti (0,58–1,82 µg ml⁻¹) rispetto al suolo (0,29–0,59 µg ml⁻¹). L’analisi DGGE ha evidenziato cambiamenti temporali nella struttura delle comunità arricchite, con una similarità del 20% tra T0 e T3 nei sedimenti e solo del 5% nel suolo, indicando una maggiore variazione nelle comunità del suolo. I microbiomi ottenuti a seguito delle colture di arricchimento (T0 e T3) sono stati testati al fine di valutare la loro capacità di degradazione di composti PFAS. Tuttavia, nei test di abbattimento condotti per 87 giorni con PFOA (25 mg L⁻¹) e PFHxS (10 mg L⁻¹), non è stata osservata alcuna significativa rimozione dei PFAS, indicando l’assenza di biodegradazione o trasformazione attiva nelle condizioni sperimentali adottate. A seguito delle colture di arricchimento sono stati isolati complessivamente 158 ceppi batterici (103 unità tassonomiche operative) e 53 ceppi fungini. I generi dominanti includevano Pseudomonas, Flavobacterium, Microbacterium, Brucella, Brevundimonas e Rhodanobacter tra i batteri, e Galactomyces, Trichosporon, Candida, Geotrichum e Fusarium tra i funghi. Sei isolati (Brevundimonas sp. 9T2SB, Chryseobacterium sp. 5T2LA, Sphingobacterium spp. (9T2LB, 5T3SA), Geotrichum sp. 3T2SA, and Candida sp. 4T2SB) hanno mostrato crescita apparente in presenza di PFOA (50 mg L⁻¹). Tuttavia, i test di biotrasformazione con diversi PFAS non hanno evidenziato rilascio di fluoruro o degradazione. Diversamente, saggi condotti in condizione di co-metabolismo con fluoxetina, è stata osservata una significativa rimozione di fluoruro dal composto fluoxetina, indicando una capacità di defluorinazione di composti fluorurati meno recalcitranti. In sintesi, la crioconservazione ha determinato cambiamenti progressivi nella vitalità microbica e nell’attività funzionale nel tempo, mentre analisi colture-dependent utilizzando come target il DNA non hanno evidenziato variazioni in funzione del tempo di conservazione. Nonostante l’isolamento di numerosi microrganismi a seguito di colture d’arricchimento, non è stata osservata una loro capacità di biotrasformazione dei PFAS. Tuttavia, alcuni isolati hanno mostrato capacità di defluorinazione della fluoxetina in condizioni co-metaboliche. Questi risultati evidenziano sia l’importanza della conservazione dei microbiomi associati ai PFAS sia le difficoltà intrinseche nella loro biodegradazione, sottolineando la necessità di ulteriori studi. A supporto di questo lavoro, sono state sviluppate e validate procedure operative standard (SOP) per il campionamento e l’estrazione del DNA. La validazione inter-laboratorio ha dimostrato buona riproducibilità e coerenza tra le unità di ricerca, senza differenze significative nella diversità microbica, nella struttura della comunità e nella composizione tassonomica.