ENDOTHELIAL EVALUATION FOR CORNEAL TRANSPLANTATION: FROM PERIOPERATIVE ASSESSMENT TO REAL WORLD OUTCOMES

Corneal endothelial cells are responsible for the maintenance of corneal deturgescence, acting as both barriers and active pumps to preserve corneal clarity trough optimal levels of stromal hydration. Endothelial cell density (ECD) is critical, as these cells do not proliferate in vivo; loss below a physiologic threshold impairs deturgescence and results in corneal edema. Therefore, the density of endothelial cells in cases of corneal transplantation has been described as one of the major determinants of long-term graft survival. However, ECD only represents a proxy of corneal endothelial viability, and its measurement and validity have shown significant shortcomings. Furthermore, a final quality assessment for the surgeons performing the corneal transplantation is currently not readily available or validated. The aim of this doctoral dissertation is to describe the efforts of our research group, led by the candidate, Dr. Airaldi, and his tutor, Prof. Romano, and composed of international and translational experts, to devise, validate and implement a method for perioperative endothelial viability assessment in corneal transplantation. The dissertation follows the journey of donor corneas from retrieval to eye bank processing to corneal transplantation, highlighting the role of endothelial evaluation at each step and strategies to minimize damage and improve quality control. Following a comprehensive literature review of techniques of corneal preservation in the eye bank, endothelial evaluation methods and strategies to minimize endothelial damage, the first study focuses on the development of a multicentric protocol for a perioperative endothelial evaluation of corneal grafts in the operating room, and the institution of an international cohort of patients with the objective of correlating transplantation outcomes with measurements of preoperative endothelial viability. The second study describes the ex-vivo development and validation process of the Viability Control of Human Endothelial Cells before Keratoplasty (V-CHECK) method to analyse endothelial viability of corneal grafts. This method leverages the use of a vital dye, Trypan Blue, and a foundation segmentation model coupled with computer vision algorithms to automatically measure the degree of endothelial mortality in surgical microscope images of corneal grafts. The third study describes the implementation of the V-CHECK method in a subset of patients undergoing Ultrathin Descemet Stripping Automated Endothelial Keratoplasty (UT-DSAEK), linking the V-CHECK measured mortality to an increase in the risk of developing early corneal graft failure. This study also describes a peculiar and novel finding, a fingerprint-like staining of corneal endothelium, that can be seen in UT-DSAEK grafts and is a marker of increased endothelial cell loss. The fourth study is a large multicenter survival analysis of UT-DSAEK grafts involving 379 patients who underwent endothelial keratoplasty at 8 Italian cornea services. Grafts with the same provenance as those displaying fingerprint-like staining in our previous study showed markedly lower survival rates compared to those coming from a different Eye Bank, highlighting possible issues in the current supply chain. Collectively, this work validates the V-CHECK method as a reliable, independent quality assurance tool. Its integration into surgical workflows empowers surgeons to identify high-risk grafts, standardizing pre-operative assessment and potentially improving the long-term survival of corneal transplants.

Le cellule endoteliali corneali mantengono la deturgescenza corneale agendo come barriera e come pompa attiva, preservando la trasparenza attraverso un’idratazione stromale ottimale. La densità delle cellule endoteliali (ECD) è cruciale, poiché queste cellule non proliferano in vivo; una riduzione al di sotto di una soglia fisiologica compromette la deturgescenza e causa edema corneale. Di conseguenza, l’ECD è considerata uno dei principali determinanti della sopravvivenza a lungo termine del lembo corneale nel trapianto. Tuttavia, l’ECD rappresenta solo un indicatore indiretto della vitalità endoteliale e presenta limiti significativi in termini di misurazione e validità. Inoltre, manca attualmente una valutazione finale della qualità del lembo che sia disponibile e convalidata per i chirurghi. Lo scopo di questa tesi di dottorato è descrivere il lavoro del nostro gruppo di ricerca, guidato dal candidato, dott. Airaldi, e dal tutor, prof. Romano, insieme a esperti internazionali con competenze traslazionali, finalizzato a ideare, convalidare e implementare un metodo per la valutazione perioperatoria della vitalità endoteliale nel trapianto di cornea. La tesi segue il percorso delle cornee dei donatori, dal recupero alla lavorazione in banca degli occhi fino al trapianto, evidenziando il ruolo della valutazione endoteliale in ogni fase e le strategie per ridurre il danno e migliorare il controllo di qualità. Dopo un’ampia revisione della letteratura sulle tecniche di conservazione, sui metodi di valutazione endoteliale e sulle strategie di protezione cellulare, il primo studio si concentra sullo sviluppo di un protocollo multicentrico per la valutazione perioperatoria dei lembi in sala operatoria e sulla creazione di una coorte internazionale per correlare gli esiti clinici con le misurazioni preoperatorie della vitalità endoteliale. Il secondo studio descrive lo sviluppo e la convalida ex vivo del metodo “Viability Control of Human Endothelial Cells before Keratoplasty (V-CHECK)”, che utilizza il Trypan Blue e un foundation model di segmentazione, combinato con algoritmi di visione artificiale, per misurare automaticamente la mortalità endoteliale su immagini da microscopio chirurgico. Il terzo studio riguarda l’implementazione del V-CHECK in pazienti sottoposti a cheratoplastica endoteliale ultrasottile (UT-DSAEK), dimostrando un’associazione tra maggiore mortalità endoteliale e aumento del rischio di fallimento precoce del lembo. Viene inoltre descritto il riscontro innovativo di una macchia a forma di impronta digitale sull’endotelio di numerosi lembi UT-DSAEK, indicativa di aumentata perdita cellulare. Il quarto studio è un’analisi multicentrica su 379 pazienti operati in 8 centri italiani, che evidenzia una ridotta sopravvivenza dei lembi provenienti dalla stessa fonte associata al reperto “a impronta digitale”, suggerendo criticità nella catena di approvvigionamento. Nel complesso, questo lavoro convalida il metodo V-CHECK come strumento indipendente e affidabile di garanzia della qualità, potenzialmente integrabile nei flussi di lavoro chirurgici per migliorare la selezione e la prognosi dei lembi corneali.