THE POTENTIAL OF BOTANICALS TO TARGET INFLAMMATION AND CELLULAR SENESCENCE: A FOCUS ON NEUROPROTECTION

Plants represent one of the main sources of bioactive natural compounds, due to their ability to produce a wide range of secondary metabolites involved in defense mechanisms against environmental stressors. These molecules exhibit great structural diversity and are associated with multiple biological activities of pharmacological interest, including anti-inflammatory, antioxidant, antitumor, and antimicrobial properties. Consequently, in recent years the pharmaceutical industry has shown a growing interest in natural products as a potential source for the development of new drugs and dietary supplements. The first part of my PhD project focused on the characterization of the biological activity of extracts obtained from the aerial parts and roots of Cistus monspeliensis L., as well as essential oils from the Lavandula genus, evaluating their potential use as neuroprotective agents. For C. monspeliensis, a preliminary characterization of the phytochemical profile of the extracts was carried out by 1H NMR analysis, since differences in metabolite composition can significantly influence biological activity. Subsequently, anti-inflammatory and antioxidant activities were assessed in vitro using RAW 264.7 and SH-SY5Y cell lines. In parallel, the inorganic profile of the extracts was analyzed by TXRF in order to evaluate their safety and efficacy. The results highlighted that hydroalcoholic extracts from aerial parts and roots exhibit distinct metabolic profiles, which are associated with different biological responses. In particular, only the root extract was able to significantly reduce the expression of the pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in the presence of LPS. Moreover, in SH-SY5Y cells, treatment with the root extract improved mitochondrial functionality, increased ATP production and catalase enzyme activity. The analysis of the inorganic profile did not reveal the presence of toxic elements, thus confirming the safety of the extracts. Another part of the study focused on the characterization of the antioxidant activity of essential oils from Lavandula angustifolia subsp. pyrenaica and two lavandin cultivars, compared with a commercial essential oil. Phytochemical characterization was performed using GC-MS, while biological activity was evaluated in the SH-SY5Y cell line. The metabolic profiles were largely comparable among the different essential oils, with the exception of some additives detected in the commercial product, which may potentially compromise its therapeutic properties. Consistently, only the laboratory-produced essential oils exhibited a protective effect against H₂O₂-induced oxidative damage and were able to increase the expression of genes involved in the cellular response to oxidative stress. The second part of my PhD project focused on the evaluation of cellular senescence in the AppNL-G-F murine model of Alzheimer’s disease. Senescence, defined as an irreversible arrest of the cell cycle associated with DNA damage, oxidative stress, and chronic inflammation, is closely linked to aging and age-related neurodegenerative disorders. Mice were analyzed at 4, 12, and 24 months of age by assessing senescence markers and changes in microglial morphology. The results showed that senescence increases with both aging and disease progression, with clear differences between wild-type and AppNL-G-F mice already evident at 12 months of age. Overall, this PhD project provides a foundation for the use of the AppNL-G-F mouse model in the screening of senotherapeutic compounds. Further studies are needed to evaluate the potential of the natural products investigated in this thesis as both neuroprotective and senolytic agents, with the aim of developing supplements designed to promote healthy aging and to contribute to the prevention and treatment of Alzheimer’s disease.

Le piante costituiscono una delle principali fonti di composti naturali bioattivi; queste molecole presentano una grande varietà strutturale e sono associate a molteplici attività biologiche di interesse farmacologico, tra cui proprietà anti-infiammatorie, antiossidanti, antitumorali e antimicrobiche. Di conseguenza, negli ultimi anni è cresciuto in modo significativo l’interesse dell’industria farmaceutica verso i prodotti naturali come potenziale fonte per lo sviluppo di nuovi farmaci e integratori. La prima parte del mio progetto di dottorato ha riguardato la caratterizzazione dell’attività biologica di estratti di parti aeree e radici di Cistus monspeliensis L. e di oli essenziali del genere Lavandula, valutandone il potenziale utilizzo come agenti neuroprotettivi. Per C. monspeliensis è stata inizialmente effettuata una caratterizzazione del profilo fitochimico degli estratti mediante analisi 1H NMR, poiché un diverso contenuto di metaboliti può influenzarne l’attività biologica. Successivamente, l’attività anti-infiammatorie e antiossidante sono state valutate in vitro sulle linee cellulari RAW 264.7 e SH-SY5Y. Parallelamente, è stato analizzato il profilo inorganico degli estratti tramite TXRF, al fine di verificarne sicurezza ed efficacia. I risultati hanno evidenziato che gli estratti idroalcolici di parti aeree e radici presentano profili metabolici distinti, associati a differenti risposte biologiche. In particolare, solo l’estratto di radici è stato in grado di ridurre in modo significativo l’espressione delle citochine infiammatorie IL-1β e IL-6 in presenza di LPS. Inoltre, nelle cellule SH-SY5Y, il trattamento con l’estratto di radici ha migliorato la funzionalità mitocondriale, aumentando la produzione di ATP e l’attività dell’enzima catalasi. L’analisi del profilo inorganico non ha evidenziato la presenza di elementi tossici, confermando la sicurezza degli estratti. Un’ulteriore parte dello studio ha riguardato la caratterizzazione dell’attività antiossidante di oli essenziali di Lavandula angustifolia subsp. pyrenaica e di due lavandin cultivars, confrontati con un olio essenziale commerciale. La caratterizzazione fitochimica è stata effettuata tramite GC-MS, mentre l’attività biologica è stata valutata sulla linea cellulare SH-SY5Y. I profili metabolici sono risultati simili tra i diversi oli, ad eccezione di alcuni additivi presenti nel prodotto commerciale, potenzialmente in grado di comprometterne le proprietà terapeutiche. Coerentemente, solo gli oli essenziali prodotti in laboratorio hanno mostrato un effetto protettivo contro il danno ossidativo indotto da H₂O₂ e un aumento dell’espressione di geni coinvolti nella risposta allo stress ossidativo. La seconda parte del mio progetto di dottorato si è focalizzata sulla valutazione della senescenza cellulare nel modello murino di Alzheimer AppNL-G-F. La senescenza, caratterizzata da un arresto irreversibile del ciclo cellulare associato a danno al DNA, stress ossidativo e infiammazione cronica, è strettamente correlata all’invecchiamento e alle patologie neurodegenerative. I topi sono stati analizzati a 4, 12 e 24 mesi valutando marker di senescenza e alterazioni della morfologia microgliale. I risultati hanno mostrato che la senescenza aumenta con l’età e con la progressione della patologia, con differenze evidenti già a 12 mesi tra topi WT e AppNL-G-F. Questo progetto di dottorato pone le basi per l’utilizzo del modello murino AppNL-G-F per lo screening di senoterapeutici. Ulteriori studi saranno necessari per valutare le potenzialità dei prodotti naturali oggetto di questa tesi sia come agenti neuroprotettivi che senolitici, con l’obiettivo di sviluppare integratori destinati a promuovere un invecchiamento sano e alla prevenzione e al trattamento della malattia di Alzheimer.