Lo splicing di NF-YA nel carcinoma colorettale: meccanismi che modellano il crosstalk tumore-stroma e opportunità terapeutiche

Aberrant splicing events are associated with colorectal cancer (CRC) and provide new opportunities for tumor diagnosis and treatment. The trimeric transcription factor NF-Y directly regulates the transcription of many genes involved in cancer-associated pathways. NF-YA, the DNA-binding subunit of the NF-Y complex, is commonly up-regulated in tumors, and a switch between the two alternatively spliced NF-YAs (short) and NF-YAl (long) transcripts occurs in tumor tissues compared to normal ones. Bioinformatic analyses of TCGA (The Cancer Genome Atlas) transcriptomic data from CRC tissues revealed higher expression of total NF-YA in tumor tissues than healthy counterparts. Moreover, different ratio of NF-YAs/NF-YAl transcripts characterizes tumor subtypes. Among consensus molecular subtypes (CMS) of colorectal cancer, CMS4, characterized by a mesenchymal phenotype, high stromal infiltration and increased TGF expression, exhibits a low NF-YAs/NF-YAl ratio. Consistently, high NF-YAl expression is associated with poorer prognosis, paralleling the prognostic stratification observed in CMS4 tumors. Through stable transduction of NF-YA isoforms, we showed that alterations in the expression of genes associated with ECM and EMT occur in NF-YAlhigh CRC cells. In vitro and in vivo assays show that NF-YAlhigh cells have a phenotype that resembles CMS4 subtypes, with increased migration and invasion ability. These results led us to study the interaction between cancer cells and the stromal component of tumor microenvironment (TME), particularly cancer-associated fibroblasts (CAFs), which promote tumor aggressiveness, establishing a stromal barrier that hinders therapeutic intervention. In vitro 3D models and conditioned medium assays demonstrate that NF-YAlhigh CRC cells induce the transformation of healthy fibroblast into CAFs, likely mediated by growth factors released by CRC cells. Growth factor antibody array analysis reveals high levels of TGF and EGFR in NF-YAlhigh and NF-YAshigh cells, respectively. The exposure of CRC cells to TGFβ induces EMT and significantly upregulates NF-YAl expression. This suggests that a positive feedback occurs, with NF-YAl-released TGF upregulating NF-YAl expression to sustain EMT and TME remodeling. siRNA specific downregulation of NF-YAl reverts TGFβ-induced EMT in CRC cells. On the other hand, NF-YAshigh cells, which resemble the CMS2 subtype characterized by high NF-YAs levels and low resistance to anti-EGFR therapies, display increased EGFR expression. Analysis of resistance to anti-EGFR therapy with Cetuximab confirmed that NF-YAshigh cells are more sensitive to treatment. These results suggest that the expression levels of NF-YA isoforms could be used to stratify patients predicting tumor aggressiveness and therapeutic response. Finally, we focused on the molecular mechanisms governing NF-YA alternative splicing. From the analysis of 42 RNA Binding Protein (RBPs) predicted to regulate NF-YA splicing, we identified few candidates potentially involved in NF-YA alternative splicing during EMT. Overall, our findings may pave the way to new therapeutic approaches, either through ASOs targeting NF-YA isoforms or siRNA-based strategies against RBPs upregulated in specific CRC CMS subtypes.

L’alterazione dei meccanismi di splicing alternativo può essere associata all’insorgenza del cancro colorettale (CRC) e fornisce nuove opportunità per la diagnosi e il trattamento di tumori. Il fattore di trascrizione trimerico NF-Y regola direttamente l’espressione di geni coinvolti nelle vie molecolari associate all’insorgenza dei tumori. NF-YA, la subunità di NF-Y che lega il DNA, è generalmente sovra espressa nei tumori, dove si osserva uno switch tra i due trascritti di splicing alternativo NF-YAs (short) e NF-YAl (long) rispetto ai tessuti sani. Le analisi bioinformatiche dei dati trascrittomici depositati nel database The Cancer Genome Atlas evidenziano un’elevata espressione di NF-YA nei tessuti di CRC rispetto a quelli sani. Il diverso rapporto dei trascritti NF-YAs/NF-YAl caratterizza i sottotipi tumorali CMS (Consensus Molecular Subtypes) del CRC: in particolare, il CMS4, caratterizzato da un fenotipo mesenchimale, un’elevata infiltrazione stromale ed un aumento dell’espressione di TGF, presenta il minore rapporto NF-YAs/NF-YAl. Coerentemente, un’elevata espressione di NF-YAl è associata ad una prognosi più infausta, come osservato nei tumori CMS4. La trasduzione delle isoforme di NF-YA ha dimostrato un’alterazione dell’espressione dei geni associati all’ECM e all’EMT nelle cellule CRC NF-YAlhigh. Le cellule NF-YAlhigh presentano un fenotipo simile al CMS4 con aumentata capacità migratoria ed invasiva, sia in vivo che in vitro. Sulla base di questi risultati, abbiamo investigato l’interazione tra le cellule CRC e la componente stromale del microambiente tumorale (TME), in particolare i fibroblasti associati al tumore (CAFs) che caratterizzano il CMS4, aumentando l’aggressività tumorale e incrementando la resistenza alle terapie. Modelli in vitro 3D ed esperimenti di condizionamento con terreni di coltura mostrano che le cellule CRC NF-YAlhigh possono indurre la trasformazione dei fibroblasti sani a CAFs, grazie a fattori di crescita rilasciati dalle cellule CRC. L’analisi dei fattori di crescita tramite array evidenzia livelli elevati di TGF ed EGFR rispettivamente nelle cellule NF-YAlhigh e NF-YAshigh. Il trattamento di cellule CRC con TGF porta ad un ‘aumentata espressione dei geni EMT e di NF-YAl. Ciò suggerisce l’esistenza di un possibile feedback positivo, dove NF-YAl rilascia TGF che a sua volta incrementa l’espressione di NF-YAl, favorendo l’EMT e rimodellando il TME. La riduzione specifica di NF-YAl mediante siRNA inverte il fenotipo EMT indotto dal TGF nelle cellule CRC. Diversamente, le cellule NF-YAshigh presentano un fenotipo simile al CMS2, caratterizzato da alti livelli di NF-YAs e bassa resistenza alle terapie anti-EGFR, associata ad un’elevata espressione di EGFR. I livelli di espressione delle isoforme di NF-YA potrebbero quindi essere utilizzati per stratificare i pazienti predicendo l’aggressività tumorale e la risposta alle terapie. Infine, ci siamo focalizzati sui meccanismi molecolari che regolano lo splicing alternativo di NF-YA: l'analisi di 42 proteine leganti l'RNA (RBP) predette come regolatrici dello splicing di NF-YA ha permesso di identificare alcuni candidati in grado di indurre NF-YAl durante l'EMT. Nel complesso, i nostri risultati potrebbero aprire la strada a nuovi approcci terapeutici, sia attraverso ASO mirati alle isoforme NF-YA, sia attraverso strategie basate su siRNA contro le RBP sovra espresse in specifici sottotipi di CRC.