Study of structure and fibrillation process of proteins using spectroscopy and nanotechnology

Proteins play a vital role in all the processes taking place in a living organism. However, under pathological conditions, they may assemble as fibrils that are toxic and may cause a wide range of neurodegenerative disorders leading eventually to death. Studying proteins and fibrils can serve as a significant step toward new ways of diagnosis and therapy. This thesis proposes some spectroscopic techniques, mainly circular dichroism and plasmonic circular dichroism, to study proteins structures and to monitor fibril formation in vitro and in vivo. Chapter I is an introduction from literature of the two major subjects of this thesis: protein fibrils and spectroscopic techniques. The first part of this chapter delivers knowledge about the process, causes and toxicity of fibrillation taking Parkinson’s disease as an example of neurodegenerative disorder. The second part deals about chirality, circularly polarized light, circular dichroism and nanoparticles as they are the basics of the spectroscopic techniques used in this work. Chapter II is devoted to fibrils generated from alpha synuclein. This chapter illustrates how plasmonic circular dichroism was used to detect and differentiate between fibrils generated in vitro from full-length alpha synuclein and from a truncated form thereof. The technique was also applied to fibrils extracted and purified from different biological systems such as neuroblastoma cells and brain homogenates of mice and human patients. Chapter III explores two other protein systems: insulin, representing an easily available model for fibrils, and superoxide dismutase 1. Insulin fibrils with two opposite handedness were generated in vitro under denaturant conditions. These fibrils were then analyzed by fluorescence, circular dichroism, circularly polarized luminescence and plasmonic circular dichroism. Dyes such as thioflavin T, congo red and bis-ANS have been used. As a preliminary study for another system which may undergo fibrillation, superoxide dismutase 1 has been considered. In particular the native protein has been compared to the one produced in ambient with Cadmium excess. The two forms have been examined with far UV-CD spectroscopy at variable temperature to monitor changes and differences in the secondary structure.

Le proteine giocano un ruolo fondamentale nello svolgimento delle varie funzioni degli organismi viventi. Tuttavia, in condizioni patologiche, esse possono aggregarsi in fibrille tossiche che possono causare una grande varietà di disfunzioni neurodegenerative. Lo studio di proteine e fibrille potrebbe portare importanti innovazioni nella diagnosi e terapia delle varie malattie collegate ad esse. In questa tesi sono presentate alcune tecniche spettroscopiche, principalmente dicroismo circolare e dicroismo circolare plasmonico, utilizzate per studiare la struttura proteica ed identificare fibrille in vitro e in vivo. Il capitolo I è una introduzione, tratta dalla letteratura, dei due principali oggetti di questa tesi: fibrille e tecniche spettroscopiche. La prima parte di questo capitolo affronta l’evoluzione, le cause e la tossicità della fibrillazione, prendendo come esempio di malattia neurodegenerativa il Morbo di Parkinson. Nella seconda parte viene trattata la chiralità, la luce circolare polarizzata, il dicroismo circolare e le nanoparticelle, essendo queste le basi delle tecniche spettroscopiche usate in questo lavoro. Il Capitolo II è dedicato alle fibrille di alfa-siucleina. Questo capitolo illustra come è stato utilizzato il dicroismo circolare plasmonico nell’individuazione e differenziazione tra fibrille generate in vitro da alfa-sinucleina in forma integra ed in forma tronca. Lo stesso metolo d’analisi è stato inoltre applicato a fibrille estratte e purificate a partire da diversi sistemi biologici, quali cellule di neuroblastoma, omogenati cerebrali di topo e di pazienti umani. Il Capitolo III esplora due altre proteine, cioè l’insulina usata come modello semplice per fibrille e superossido dismutasi1. Fibrille di insulina con due sensi di avvolgimento, destro e sinistro, sono state generate in vitro in condizioni denaturanti e sono state analizzate mediante fluorescenza, dicroismo circolare, luminescenza circolarmente polarizzata e dicroismo circolare plasmonico. Sono stati usati anche coloranti fluorescenti come tioflavina T, congo red e bis-ANS. Come studio preliminare per una altra proteina che potrebbe subire fibrillazione, é stata considerata la superossido dismutasi 1. In particolare, la proteina nativa é stata confrontata con quella sintetizzata in presenza di cadmio. Le due forme sono state esaminate con dicroismo circolare nella regione dell’ultravioletto lontano al variare della temperatura, al fine di monitorare cambiamenti e differenze nella struttura secondaria.