PRECLINICAL AND PROTEOMIC EVALUATION OF A STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS CLINICAL ISOLATE IN ORTHOPEDIC BIOFILM-RELATED INFECTIONS

Non-union fractures, as a severe failure of bone healing, are among the most difficult and challenging orthopedic complications. Non-unions represent a clinical burden, as well as a socioeconomic encumbrance that decreases the quality of patients’ lives and requires surgical treatment and long recovery times which increases the burden on the National Health Service. The percentage of fractures leading to non-union is between 5 and 10% and generally occurs in long bones like tibia, femur, humerus, radius, and ulna. Non-unions are strictly related to local bone loss caused, for example, by trauma or tumors; they may depend on patient health status (e.g. age, metabolic disease, comorbidities). In addition, they are frequently caused by bacterial infections established during surgical procedures (e.g. osteosynthesis, open fractures) and are referred to septic or infected non-unions. The most common bacteria involved in infected non-unions are Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis and bacterial contamination accounts for the two-thirds of the clinical cases. In particular, S. epidermidis is of utmost importance, being one of the most significant bacteria related to hospital-acquired infections. S. epidermidis is an inhabitant of healthy human skin and mucosal flora and it is a commensal bacterium characterized by a low pathogenic potential. However, this pathogen has emerged as a common cause of numerous nosocomial infections associated with medical devices (e.g. catheters, pacemaker, metal implants, etc.), because of its capability to create a protective niche on the surface of implanted orthopedic devices, called biofilm. Biofilm is a thick matrix of extracellular polymeric substances derived from sessile bacteria irreversibly attached to a substratum. Within the biofilm, microorganisms establish organized hierarchies similar to that of multicellular organisms; cell-to-cell signaling regulates the expression of genes involved in survival mechanisms, depending on environmental influences. Thus, biofilm confers a protective niche to pathogens in which they can grow and evade host immune defenses and antimicrobial treatments, leading to the development of antimicrobial-resistant strains, such as methicillin-resistant S. epidermidis (MRSE). Moreover, because of the ubiquitous prevalence of S. epidermidis as a commensal bacterium on human skin, it is often difficult to discern whether a clinical isolate represents the causative agent of an infection or an unspecific culture contaminant. In order to study S. epidermidis-associated infections in orthopedic implants, animal models are extremely useful to investigate the pathogenesis of biofilm-related non-union, with particular regard to subclinical infections. For the aforementioned reason and to fulfill the lack of knowledge in the literature, we established a preclinical model of methicillin-resistant S. epidermidis non-union in order to assess the role of subclinical infections in orthopedic and trauma surgery. Indeed, an animal model of infected nonunion able to resemble the features of a nosocomial implant-associated infection was generated, in order to investigate new preventive or therapeutic options. Thus, we evaluated the incidence of infected non-unions caused by dose-dependent concentrations of methicillin-resistant S. epidermidis (MRSE) in rats subjected to femoral fracture osteosynthesis with metal implants. At the end of the first experimental phase, we identified the lowest bacterial load of MRSE able to induce a clinical infected non-union. In particular, we determined that a low grade bacterial injection determines a subclinical infection, whereas the intermediate grade inoculum determines a clear acute clinical infection and the highest bacterial inoculum is able to form a visible biofilm upon the implant surface, impeding fracture healing in all the treated animals. The development of a valid animal model is crucial for the subsequent experimental phases, allowing us to study the complex physiopathology of non-unions caused by microorganisms in order to optimize therapeutic strategies. To treat non-unions, several therapeutic approaches are described in the literature, such as surgical debridement or local or systemic antibiotic therapies. Recently, also bone tissue engineers are developing biological or synthetic scaffolds with osteoinductive and antibacterial proprieties. However, most of these innovative materials used as drug delivery may have some drawbacks, including non-biodegradability, possible microbial adhesion and biofilm formation on their surfaces, restricted range of loadable antibiotics and long-lasting release with a potential increase of antibiotic resistance. Because of these limitations, hydrogels represent promising and potential alternative materials able to deliver antibiotics, growth factors or cells locally, while inducing osteogenesis and regulating bacterial bone infections associated with orthopedic devices. Recently, an innovative hydrogel composed of two biocompatible polymers (hyaluronic acid and poly-lactic acid) was tested in vitro and subsequently validated in vivo, as a bio-resorbable barrier against infections. However, it is not known yet if this hydrogel also possesses osteoinductive and/or osteoconductive properties. Moreover, in the last few years, bone tissue engineering and cell-based therapies reported some impressive results in the regeneration of organs or tissues, as well as in the treatment of non-septic non-unions. The cell therapy approach aims to deliver healthy cells able to produce new calcified matrix within the damaged tissue in order to fix the loss of function. Mesenchymal stromal cells (MSCs) have prompted significant interest in biomedical research and cell-based therapies due to their ability to self-renew, differentiate in vitro into mesenchymal tissues, such as bone, cartilage, or fat and as an easily accessible source of autologous cells. Furthermore, some recent studies demonstrated the immunomodulatory and antimicrobial features of MSCs. Finally, recent studies demonstrated that MSCs can limit bacterial growth in vivo thanks to the aforementioned proprieties able to modulate the inflammatory response and macrophage activation at the site of infection. Nevertheless, the mechanism of action of MSCs in the modulation of the inflammatory process is still unclear. Finally, the lack of the major histocompatibility complex II (MHC II) in MSCs could permit the allogeneic transplant of these cells. Aiming at testing innovative preventive and/or therapeutic strategies through our model of septic non-unions, the goal of the second experimental phase was to evaluate the efficacy of an innovative hydrogel, with presumed osteoinductive and antibacterial proprieties, to prevent and control the progression of bacterial biofilm formation in infected non-unions. Along with this goal, we investigated the feasibility and the efficacy of MSCs-based therapy to control both the inflammatory response and bacterial growth/spread in vivo. Specifically, immunocompetent rats, already exposed to a femoral fracture infected with MRSE, were inoculated with allogeneic mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow (BMSCs) through two different administration routes – systemic (circulatory system) and local injection (fracture site). Through this study, we evaluated both the immunoregulatory effects of BMSCs, but also the osteoinductive proprieties of these cells able to produce calcified matrix in the damaged tissue. Similarly, we assessed the ability of an enriched hydrogel to prevent/treat infected non-unions by inhibiting biofilm formation and stimulating bone deposition due to its antibacterial and osteoinductive proprieties. The overall and anticipated goal of this first part of the project was to establish new therapeutic strategies for the prevention and the treatment of infected non-unions, which result in morbidity and, sometimes, limb loss in critical patients. These results may have an important impact on the treatment of the infected non-union in orthopedics. Moreover, these tested therapeutic strategies may also be used synergically to locally deliver cells due to the engineered hydrogel to optimize physiological pathways of fracture healing and to control the progress of local inflammations/infections. Another potential use of the therapies from this study would be the use of animal models affected with comorbidities (e.g. type I and II diabetes) instead of healthy animals, in order to translate the findings on complex infections that may occur in orthopedics. In the first experimental phase, all efforts were made to discourage bacterial attachment on the surface of metallic implants impairing the bacterial “race to the surface” while favoring the eradication of the infection and the fracture healing process. However, our animal model of septic non-union was unable to elucidate how the infection was suppressed and why bacteria were not able to form biofilm in the presence of the hydrogel or BMSCs. Thus, in order to decipher the genetic basis of biofilm formation, the second phase of this project focused on the in vitro analysis of the proteome of S. epidermidis when growing in planktonic or in sessile forms on sandblasted titanium. Staphylococcus epidermidis does not encode many pathogenicity islands, and its principal virulent property is the ability to establish organized communities which regulate the expression of genes involved in the survival mechanisms and biofilm formation on implants. Indeed, biofilm provides bacteria the means to evade the host immune defense. However, the complete pathway that regulates biofilm in vivo is not well understood. Thus, aiming at defining markers expressed by mature staphylococcal biofilm on metallic implants, in the last experimental phase, we analyzed the proteome of two different strains of S. epidermidis in both planktonic and sessile forms. In particular, we compared the whole proteomic profile of two different S. epidermidis strains, when growing in their planktonic and sessile forms, in a static culture system. We focused our attention on S. epidermidis ATCC 35984, a commercially-available bacterial species isolated from catheter sepsis and which the genome is already deposited in GeneBank, and on methicillin-resistant S. epidermidis GOI1153754-03-14 used in our previous studies. First, the entire genome of S. epidermidis GOI1153754-03-14 was sequenced using Next Generation Sequencing not only to obtain the genome but also to analyze the protein profile. Indeed, the whole genome sequence of the clinical isolate was crucial for proteomic analysis in order to highlight the functional mechanisms of biofilm formation. Then, ATCC 35984 and the clinical isolate GOI1153754-03-14 were statically cultured in their planktonic and sessile forms for 72 hours to establish a mature biofilm. The sessile culture was carried out on sandblasted titanium disks on which bacteria adhered and formed the biofilm; conversely, the planktonic culture was incubated under agitation to prevent cell clustering. Bacteria were then recovered, collected and lysed to extract and separate the proteins by pH and molecular weight. Differences in the two-dimensional gels were evaluated and the variably expressed spots were identified through mass spectrometry analysis. However, data obtained in our study revealed that many changes in the protein expression in both S. epidermidis strains occurred when planktonically cultured. In particular, the analysis of the proteins expressed by planktonic bacteria rafter 72 hours revealed results linked to a bacterial stress condition due to the culture condition. A limitation of this experimental setup was the variation of the proteomic profile associated with the static culture system. The chosen experimental time point represents a limit of this study, but also an important clue for future analyses in which the same proteomic analysis may be carried out at different time points in order to overcome the limitation due to the cell density while allowing the comparison of their proteome at the same experimental time point. The primary purpose of this final part of the research was to define how protein expression varies between two different bacterial strains belonging to the same species and how culture conditions can modulate these differences. Comparative proteomic analyses may allow the scientific community to understand the molecular pathways associated with biofilm formation on implants, thus identifying potential therapeutic targets or diagnostic biomarkers.

Il termine pseudoartrosi è riferito a un tipo di frattura caratterizzata dall’impossibilità di una fisiologica guarigione. Le pseudoartrosi sono tra le complicazioni ortopediche più complesse non solo a livello clinico, ma anche a livello socio-economico incidendo drasticamente sia sulla qualità di vita dei pazienti colpiti, sia sulle casse dei Sistema Sanitario Nazionale. Si stima che il 5-10% dei casi di frattura vada incontro allo sviluppo di pseudoartrosi e generalmente le ossa maggiormente interessate a questo fenomeno sono le ossa lunghe, tra le quali tibia, femore, omero, radio e ulna. Lo sviluppo di pseudoartrosi può conseguire la perdita di sostanza ossea, ad esempio a seguito di traumi o alla resezione di tumori, ma non solo, può anche derivare da una frattura che non riesce a consolidarsi. I fattori che possono maggiormente influenzare la corretta guarigione del tessuto osseo sono molteplici e spesso correlati allo stato di salute del paziente: la presenza di malattie metaboliche, l’età, le abitudini alimentare e il fumo incidono drasticamente sul processo di guarigione della frattura. Un’ulteriore causa dello sviluppo di pseudoartrosi è l’insorgere di infezioni date da contaminazioni che possono susseguire fratture esposte o che possono avere luogo in sede operatoria. In questi casi si parla di pseudoartrosi settiche. È stato stimato che circa i due terzi dei casi clinici di pseudoartrosi settiche sono dovuti alla presenza di stafilococchi e più specificatamente alla presenza di Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. In particolare, S. epidermidis è stato recentemente riconosciuto come un importante patogeno opportunista coinvolto nell’aumento di infezioni nosocomiali, essendo comunemente presente sulla cute umana. S. epidermidis è un microrganismo commensale presenta fisiologicamente nella flora di pelle e mucose. A causa della sua presenza ubiquitaria è spesso difficile distinguere se un isolato clinico di S. epidermidis rappresenta l’agente causale di un’infezione o un contaminante non specifico della coltura. A differenza di S. aureus, S. epidermidis non esprime molteplici fattori di virulenza; è contraddistinto come patogeno dalla abilità di formare biofilm sulla superficie di impianti o device introdotti all’interno del nostro corpo (ad esempio protesi, pacemakers, cateteri ecc.). Il biofilm è una spessa matrice extracellulare secreta da batteri sessili irreversibilmente attaccati ad un substrato. All’interno del biofilm i microrganismi creano comunità organizzate in cui, a seconda delle influenze ambientali, la comunicazione tra cellula e cellula regola l’espressione di geni coinvolti in meccanismi di sopravvivenza. Pertanto il biofilm costituisce una nicchia protettiva, un luogo in cui proliferare e sfuggire alle difese immunitarie dell’ospite e ai trattamenti antibiotici, portando allo sviluppo di antibiotico resistenze. Un mezzo fondamentale e necessario per lo studio della patogenesi delle pseudoartrosi settiche sono i modelli preclinici, grazie ai quali è possibile indagare come i batteri interagiscano con l’impianto e formino biofilm su di esso. In letteratura, ad oggi, non sono presenti modelli di pseudoartrosi settica causata da S. epidermidis e pertanto nella prima fase del progetto di dottorato è stato quindi generato un modello di pseudoartrosi settica in grado di mimare un’infezione nosocomiale caratterizzata dalla presenza di un impianto metallico, al fine ultimo di indagare nuove strategie preventive e terapeutiche. Con l’obiettivo di identificare la carica batterica minima in grado di portare allo sviluppo di pseudoartrosi settiche, i ratti sono stati sottoposti a una frattura femorale in cui, a seconda del gruppo sperimentale, sono state inoculate diverse concentrazioni di S. epidermidis meticillino-resistente (MRSE). Grazie a questo modello siamo stati in grado di definire tre differenti modelli preclinici. È stato infatti possibile dimostrare come un basso inoculo batterico (10^3 CFU/inoculo) è in grado di determinare un modello subclinico di pseudoartrosi settica, caratterizzata dalla sporadica presenza di pochi segni clinici di infezione. Abbiamo inoltre descritto come un inoculo intermedio (10^5 CFU/inoculo) sia in grado di determinare segni acuti di infezione e come un inoculo alto (10^8 CFU/inoculo) sia capace di portare ad una rapida formazione di biofilm sull’impianto e quindi allo sviluppo di pseudoartrosi in tutti gli animali trattati. I successi ottenuti in questa prima fase del progetto hanno reso possibile la realizzazione della successiva fase sperimentale in cui, grazie al modello di infezione acuta, abbiamo potuto testare l’efficacia di nuove strategie preventive. In letteratura sono descritti diversi approcci terapeutici per il trattamento di pseudoartrosi settiche e tante nuove ricerche stanno cercando di ottimizzare un trattamento che ancora ad oggi non è presente. L’ingegneria tissutale, ad esempio, da anni studia l’utilizzo di scaffold biologici o sintetici con proprietà osteoinduttive e antibatteriche per scagionare l’instaurazione di infezioni favorendo allo stesso momento la rigenerazione del tessuto osseo. Tuttavia la maggior parte delle proposte sviluppate possiede delle limitazioni, legate, ad esempio, alla non biodegradabilità del materiale che potrebbe in alcuni casi addirittura favorire l’adesione batterica o legate al tipo sostanze antibiotiche caricabili nel materiale. In questo senso gli hydrogel rappresentano un giusto compromesso, poiché in grado di fornire localmente antibiotici, fattori di crescita o cellule, sfavorendo lo sviluppo di infezioni batteriche associate a impianti. È stato recentemente sviluppato un nuovo hydrogel a base di acido ialuronico e polilattico. Test in vitro e in vivo di questo rivestimento riassorbibile hanno dimostrato come esso sia in grado di prevenire la formazione di infezioni quando associato alla presenza di antibatterico. Tuttavia, non sono ancora note le proprietà osteoinduttive/osteoconduttive che si presume abbia questo innovativo hydrogel. Altri importanti traguardi dell’ingegneria tissutale sono stati raggiunti grazie all’utilizzo di terapie cellulari, dove il trapianto di cellule progenitrice ha portato a impressionanti risultati nella rigenerazione di organi e tessuti, nonché nel trattamento di pseudoartrosi. Questo approccio mira a fornire cellule progenitrici sane in grado di produrre nuova matrice extracellulare all’interno del tessuto danneggiato per ripristinare la perdita di funzione del tessuto danneggiato. Le cellule staminali mesenchimali (mesenchymal stem cells, MSCs) hanno attirato l’attenzione dei ricercatori di questo settore come fonte facilmente accessibile di cellule autologhe in grado di differenziarsi in vitro in diversi tessuti di origine mesenchimale (ad esempio osseo, cartilagineo, adiposo). Inoltre, alcuni studi hanno descritto le proprietà immunomodulatorie e antimicrobiche di queste cellule, dimostrando come le MSCs possano limitare la crescita batterica in vivo e come possano attivamente modulare la risposta infiammatoria nel sito dell’infezione. Tuttavia, il meccanismo d’azione delle MSCs nella modulazione del processo infiammatorio non è ancora chiaro. Un’altra importante caratteristica di queste cellule è la loro mancanza del complesso maggiore di istocompatibilità II che le rende quindi candidate ideali per il trapianto allogenico. L’obiettivo della seconda fase sperimentale di questo progetto è quello di valutare l’efficacia di un innovativo hydrogel arricchito di vancomicina, nel prevenire lo sviluppo di una pseudoartrosi settica e allo stesso momento favorire la rigenerazione del tessuto osseo. L’utilizzo locale dell’hydrogel è stato comparato all’uso di vancomicina per via sistemica, essendo un trattamento standard in clinica in caso di infezione da batteri meticillino-resistenti. Parallelamente all’interno dello stesso disegno sperimentale, abbiamo valutato l’efficacia dell’utilizzo di BMSCs, cellule mesenchimale da midollo osseo, per il controllo della risposta infiammatoria e della diffusione della crescita batterica in vivo. In particolare, ratti immunocompetenti sono stati sottoposti a una frattura femorale infettata con MRSE e, successivamente, inoculati con BMSCs per via sistemica o locale a seconda del gruppo di appartenenza degli animali. Scopo dello studio non solo è stato quello di analizzare gli effetti immunomodulatori delle BMSCs attraverso la valutazione dei livelli di espressione di citochine infiammatorie, ma anche valutare le proprietà osteoinduttive delle BMSCs in grado di produrre matrice extracellulare nel tessuto danneggiato. Anche in questo caso l’uso sistemico di cellule è stato paragonato a quello locale con il fine di stabilire una via di somministrazione sicura. Per tutta la prima fase del progetto di dottorato si è ricercata una strategia in grado di impedire la colonizzazione batterica dell’impianto. Tuttavia, il nostro modello animale non è stato in grado di fornirci informazioni su come l’infezione sia stata debellata dall’organismo e quali sono stati i meccanismi attivati che hanno permesso l’eradicazione dell’infezione e della guarigione della frattura. Perché i batteri non sono stati più in grado di formare biofilm in presenza dei trattamenti? Pertanto, per rispondere a questa domanda sperimentale, nell’ultima fase del progetto di dottorato l’attenzione si è spostata sull’analisi del proteoma di S. epidermidis per capire i meccanismi molecolari che i batteri attivano quando formano e stabiliscono biofilm in vitro su inserti di titanio. Il percorso che regola la formazione del biofilm in vivo non è ancora completamente noto, ma è stato ampiamente studiato e descritto; diversamente troviamo in letteratura poche informazioni sul biofilm maturo. Pertanto, con lo scopo di individuare la chiave della stabilità del biofilm maturo, le proteine espresse da due ceppi di S. epidermidis coltivati sia in forma planctonica sia in forma sessile sono state studiate. In particolare, abbiamo concentrato la nostra attenzione sul ceppo clinico GOI1153754-03-14 e comparato la sua espressione di proteine con quelle espresse da S. epidermidis ATCC 35984, considerato il ceppo standard e cui sequenza genomica è già stata studiata e depositata in banca dati. Infatti, punto cruciale dell’analisi del proteoma dei batteri è la conoscenza del loro genoma. Perciò, per prima cosa, l’intera genoma di S. epidermidis GOI1153754-03-14 è stato sequenziato e successivamente depositato in banca dati. La presenza dell’intera sequenza genomica di un isolato clinico è cruciale sia per le nostre successive analisi, ma permetterà anche di avere una maggiora conoscenza dei ceppi clinici coinvolti in infezioni ortopediche. A seguito di questa fase preliminare necessaria, S. epidermidis GOI1153754-03-14 e ATCC 35984 sono stati staticamente coltivati in forma planctonica e in biofilm formante per 72 ore. La coltura sessile è stata condotta su dischetti di titanio sabbiato per permettere l’adesione dei batteri e la formazione di biofilm; al contrario la coltura planctonica è stata realizzata in agitazione per prevenire l’aggregazione delle cellule. I batteri poi sono stati prelevati e dopo vari lavaggi, mirati a eliminare i residui del brodo di coltura, sono stati lisati per poter estrarre le proteine. Dopo la quantificazione, le proteine sono state prima divise secondo punto isoelettrico e poi secondo peso molecolare per ottenere mappe bidimensionali contenenti singoli spot associati a una singola proteina. Gli spot statisticamente differenti sono stati poi staccati e le proteine identificate per mezzo di analisi di spettrometria di massa. Le analisi hanno rivelato l’incremento di espressione di geni legati allo stress cellulare in batteri coltivati in forma planctonica. La coltura a 72 ore ha reso possibile la formazione di biofilm sulla superficie del dischetto di titanio, ma allo stesso modo ha pregiudicato la crescita degli stessi in forma planctonica. La scelta del time point sperimentale in questo studio rappresenta la maggiore limitazione, ma allo stesso tempo un punto di partenza per valutare il proteoma di S. epidermidis a diversi tempi per lo studio dell’attivazione/repressione di geni coinvolti nella formazione e maturazione della matrice. Lo scopo principale di quest’ultima fase del progetto di dottorato e di futuri studi è quello di definire potenziali bersagli molecolari di innovative terapie o di definire nuovi biomarcatori diagnostici, tramite l’analisi delle proteine espresse dai batteri in determinate condizioni di crescita.