DEVELOPMENT OF AN IN-VITRO HUMANIZED MICROFLUIDIC PLATFORM TO STUDY NEURONAL TAU AGGREGATION AND PROPAGATION

Background: Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia, characterized by the presence of extracellular -amyloid plaques and intracellular neurofibrillary tangles (NFTs) composed of aggregated and hyperphosphorylated tau. Since it has been shown that tau aggregates correlate with cognitive decline much better than -amyloid formations, it is important to understand how tau can spread in the brain. Moreover, the spatiotemporal spread of tau observed during clinical manifestation suggests that it propagates along the axonal network between synaptically connected neurons. On these bases, some early-phase Clinical Trials are aiming to target tau during transcellular spreading in order to prevent its internalization by recipient neurons, using both compounds and antibodies. For the experimental evaluation of candidates before in vivo studies, there have been many attempts to replicate this network in vitro, most of which used microfluidic approaches; however, these experiments have often utilized parameters that may reduce the physiological relevance of the assay, such as by overexpressing tau, using fluorescent tags, or by introducing MAPT mutations. New methods that can improve these assays are required to help the screening of efficient and effective treatments. Aim of the work: The main purpose of this research project has been to establish a humanized, in vitro neuronal microfluidic platform to recapitulate and study tau aggregation and propagation in a qualitative and quantitative way. Microfluidic devices represent a miniaturized alternative tool to recapitulate tau spreading conditions, by enabling the culture of synaptically connected, but environmentally isolated, neuronal populations that can be seeded, thereby inducing endogenous tau aggregation and subsequent propagation. This model system could be ideal for testing the effect of potential tau therapeutics that modulate transneuronal tau propagation. Material & Methods: Before developing the microfluidic propagation assay, a rat cortical neuron (RCN) aggregation assay that uses seeding-competent material from human AD brains (hAD seed) to induce endogenous aggregation was validated. Subsequently, the same conditions were used to develop a RCN microfluidic assay that can show endogenous tau aggregation, and consequent propagation, using High Content Imaging (HCI) and a proprietary interactive computer program for image quantification. Finally, using a transgenic mouse line that expresses human MAPT, a humanized and miniaturized version of the assay has been developed in order to have a physiologically relevant, medium-throughput platform to test tau therapies. Results: After a phase of optimization, it has been shown that hAD seed induces endogenous rodent tau aggregation and transneuronal propagation in a quantifiable manner in a microfluidic culture model. Moreover, this assay was statistically validated and further converted to a medium-throughput format allowing the user to handle 16 two-chamber devices simultaneously in the footprint of a standard 96 well plate. Furthermore, this assay was humanized in order to study hTau aggregation and propagation using primary neurons from a mouse model that expresses human tau only. It has been proved that Anle 138b, a literature small molecule that has been previously shown to impair protein aggregation, can block the transneuronal transfer of tau aggregates, suggesting that this novel system can be used to evaluate mechanisms of tau spreading and to find therapeutic interventions. Moreover, preliminary experiments have shown that the aggregation of endogenous tau induces not only an increase of neuronal excitability but also an activation of astrocytes which might also have a role in tau pathology. Conclusions: This work has been successfully developed a robust and quantitative microfluidic assay that can model an isolated mechanism of tau propagation. Using both RCNs and hTau mouse cortical neurons seeded with hAD seed, it was possible to quantify the formation and propagation of endogenous tau inclusions and demonstrate that a putative inhibitor of tau propagation is active in this assay. It was also shown that these models can be further employed for exploratory studies, such as monitoring the functional activity and connectivity of the neuronal cultures, as well as investigating the role of different cell types in tau aggregation and propagation. Most importantly, this manuscript exhibits the latent potential of microfluidic assays as screening platforms for the preclinical evaluation of tau propagation inhibitors.

Introduzione: la patologia di Alzheimer (AD) è la causa più comune di demenza ed è caratterizzata da depositi extracellulari di -amiloide e da aggregati intracellulari chiamati grovigli neurofibrillari (NFTs) formati dalla proteina tau iperfosforilata. Poiché è stato dimostrato che il declino cognitivo dei pazienti di AD correla con la diffusione degli aggregati di tau più che con la presenza di -amiloide, è fondamentale capire i meccanismi molecolari che causano la propagazione di tau. Studi hanno dimostrato come la diffusione temporale e spaziale degli NFTs sia costante nei vari pazienti e che sia dovuta alla propagazione attraverso il network assonale tra neuroni connessi a livello sinaptico. Ad oggi infatti, alcuni degli “early phase Clinical Trials” e degli studi si stanno concentrando sulla propagazione di tau al fine di poter prevenire la sua internalizzazione da parte delle cellule riceventi, ancora sane, sia con uso di molecole che con anticorpi. Ci sono stati diversi studi per riprodurre in vitro un modello di network neuronale al fine di valutare in maniera appropriata delle terapie mirate prima che esse venissero testate in vivo, e la maggior parte di questi si basano sull’uso di microfluidica. Tuttavia, in questi modelli spesso sono stati utilizzati degli approcci poco fisiologici come l’over-espressione o la mutazione di tau o l’utilizzo di tags fluorescenti che possono compromettere l’affidabilità di questi sistemi. Per questo motivo è necessario lo sviluppo di una nuova metodologia che possa migliorare questo approccio e che potrà in fine essere utilizzata per un efficiente ed affidabile screening di nuove terapie per la malattia di Alzheimer. Scopo del lavoro: il principale obiettivo di questa ricerca è stato quello di stabilire una nuova piattaforma neuronale umanizzata di microfluidica, che potesse modellare e che permettesse lo studio, dell’aggregazione e propagazione di tau in modo sia qualitativo che quantitativo. I dispositivi di microfluidica rappresentano un’alternativa miniaturizzata per ricapitolare la propagazione di aggregati proteici come quelli di tau; infatti, essi permettono la coltura di popolazioni neuronali sinapticamente connesse ma fisicamente isolate che possono essere indotte allo sviluppo di aggregati e, conseguentemente, alla loro propagazione. Questo modello potrebbe essere ideale per testare gli effetti di potenziali terapie contro tau che vadano a contrastare la propagazione trans neuronale. Materiali & Metodi: al fine di sviluppare un modello di propagazione nei dispositivi di microfluidica, è stato in primo luogo validato un protocollo per stimolare l’aggregazione di tau endogena in neuroni corticali di ratto (RCN) utilizzando come induttore del materiale derivato da cervelli umani di pazienti AD (hAD seed). Successivamente, usando le stesse condizioni, sono stati sviluppati diversi protocolli di microfluidica per RCN che hanno mostrato non solo aggregazione ma anche propagazione di tau utilizzando tecniche quali High Content Imaging (HCI) ed un software di immagine che è stato sviluppato internamente. Infine, è stato sviluppato una versione umanizzata e miniaturizzata di questo protocollo al fine di avere una piattaforma fisiologicamente rilevante per poter testare terapie contro tau umana. Risultati: in questo progetto è stato sviluppato un modello cellulare umanizzato che permette lo studio della propagazione endogena di tau, da neurone a neurone, usando dispositivi di microfluidica. Dopo una prima fase di ottimizzazione, è stato dimostrato che utilizzando hAD seed è possibile indurre in neuroni corticali piastrati in dispositivi di microfluidica, l’aggregazione della proteina tau endogena e la sua propagazione in maniera trans-neuronale in modo quantificabile. Inoltre, questo modello è stato validato statisticamente ed è stato successivamente convertito in uno miniaturizzato per aumentare il “throughput” della piattaforma passando così da 6 a 16 unità di microfluidica contenute in una piastra. Infine, questo metodo è stato umanizzato al fine di studiare l’aggregazione e la propagazione della forma umana di tau usando una cultura primaria di neuroni murini che esprimono solo la proteina tau umana. E’ stato dimostrato che Anle 138b, una molecola conosciuta in letteratura per le sue capacità antiaggreganti, può bloccare l’aggregazione e il trasferimento trans-neuronale di tau, suggerendo che questo nuovo sistema possa essere usato per valutare i meccanismi di propagazione di tau e trovare nuove terapie. Conclusioni: In questo lavoro è stato sviluppato con successo un metodo di microfluidica quantitativo e riproducibile che può modellare le taupatie sporadiche umane come la malattia di Alzheimer. Usando sia RCN che neuroni corticali hTau trattati ed indotti con hAD seed, è stata osservata e quantificata la formazione e la propagazione di aggregati endogeni di tau ed è stato testato l’effetto di una molecola inibitoria su questi due meccanismi. È stato inoltre dimostrato come questi modelli possano essere anche utilizzati per condurre studi esplorativi come quelli volti al monitoraggio dell’attività e della connettività neuronale e gli studi sul ruolo dei diversi tipi cellulari presenti in cultura, nell’aggregazione e propagazione di tau. Soprattutto, è stato dimostrato come questo modello possa essere utilizzato come piattaforma di screening per testare potenziali inibitori della propagazione di tau murina ed umana.