DEXTRAN-SHELLED OXYGEN-LOADED NANODROPLETS PROMOTE ENTEROCOCCUS FAECALIS KILLING AND REDUCE MACROPHAGES-MEDIATED INFLAMMATION

Background: Chronic wounds represent nowadays an increasing social and economic burden in developed countries, especially in the elderly, due to the lack of effective and low-cost treatments. In the hypoxic and inflammatory milieu of non-healing ulcers, macrophages are unable to switch from the M1 pro-inflammatory to the M2 anti-inflammatory phenotype. Moreover, they counteract overlapping infections by phagocyting and killing bacteria with different mechanisms, among which the production of oxygen and nitrogen radicals. Enterococcus faecalis (E. faecalis) is a commensal Gram-positive bacterium, usually found in gastrointestinal tract, able to infect wounds and to develop high resistance to antibiotics. Since dextran-shelled oxygen-loaded nanodroplets (OLNDs), carriers able to release oxygen in a time-sustained manner, were proposed as tools able to counteract hypoxia in endothelial cells and monocytes, the aim of this work was to investigate their effects on macrophages-mediated killing of E. faecalis, and to evaluate their modulation of the inflammatory milieu, both in normoxia and hypoxia. Methods: Cytotoxicity of OLNDs and OFNDs (oxygen-free nanodroplets) on murine bone marrow-derived macrophages (BMDM) and human leukemic monocytes differentiated into macrophages by PMA (dTHP-1) was evaluated by MTT assay. FITC-conjugated OLNDs internalization in cytoplasm was analyzed by fluorescent microscopy. Effects of nanodroplets on E. faecalis ATCC 29212, was evaluated by MIC and MBC. The production of oxygen and nitrogen radicals were evaluated using the fluorescent dye H2DCFDA and the Griess assay, respectively. E. faecalis phagocytosis and killing were evaluated counting infected macrophages on Giemsa-stained slides or CFUs after the antibiotic protection assay and subsequent 24 hours of treatment. The production of inflammatory cytokines and angiogenic factors was evaluated by ELISA. All the experiments were performed in normoxia or hypoxia. Results: Nanodroplets were not toxic up to the concentration of 10% v/v and were internalized by both murine and human macrophages. They did not interfere with bacterial growth and viability. ROS and NO levels were induced in BMDM in presence of OLNDs, while dTHP-1 killing mechanisms were not affected by nanodroplets. Given the increase in NO and ROS in the presence of NDs, as expected, E. faecalis killing by murine macrophages was improved by OLNDs and OFNDs. No differences were observed between OLNDs and OFNDs indicating that the effects were probably due to the outer dextran shell of the NDs. On the contrary, dTHP-1-mediated killing was not affected by nanodroplets. In the second part of the work, the effects of nanodroplets on inflammatory and angiogenic mediators was evaluated in E. faecalis infected dTHP-1. OLNDs and OFNDs exerted an anti-inflammatory activity by reducing the pro-inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6 and TNFalpha in normoxia and hypoxia. Again, no differences between OLNDs and OFNDs effects were observed. Differently VEGF, as expected, was induced by hypoxia and, only OLNDs were able to restore a normoxia-like phenotype reducing VEGF secretion and confirming the release of oxygen by OLNDs. Conclusions: We further confirmed the potential of OLNDs as innovative tools for chronic wounds by deciphering their dual role in improving bacterial killing and reducing inflammatory response by macrophages.

Introduzione: Nei paesi sviluppati, le ulcere croniche rappresentano un problema sociale ed economico crescente, soprattutto negli anziani, a causa della mancanza di trattamenti efficaci e a basso costo. Nell’ambiente ipossico ed infiammatorio delle ulcere croniche i macrofagi perdono la capacità di transire dal fenotipo M1 pro-infiammatorio al fenotipo M2 antinfiammatorio. In aggiunta, i macrofagi contrastano le infezioni fagocitando ed eliminando i batteri attraverso diversi meccanismi, tra i quali la produzione di radicali dell’ossigeno e dell’azoto. Eneterococcus faecalis (E. faecalis) è un battere commensale Gram-positivo che colonizza il tratto gastrointestinale, ma anche capace di infettare le ferite e di sviluppare un’elevata resistenza agli antibiotici. Dal momento che nanogocce con guscio di destrano e cariche di ossigeno (OLNDs), in grado di rilasciare ossigeno lentamente nel tempo, si sono dimostrate in grado di contrastare gli effetti dell’ipossia su cellule endoteliali e monociti, lo scopo di questo lavoro è stato di studiare gli effetti delle OLNDs sul killing di E. faecalis mediato da macrofagi, e di valutare la modulazione dello stato infiammatorio, sia in normossia sia in ipossia. Metodi: La citotossicità delle OLNDs e OFNDs (nangocce non ossigenate) è stata valutata con saggio MTT sia su macrofagi da midollo osseo di topo (BMDM) sia su monociti umani da paziente leucemico differenziati in macrofagi con la PMA (dTHP-1). La localizzazione citoplasmatica delle OLNDs coniugate con il FITC è stata confermata con la microscopia a fluorescenza. Gli effetti delle nanogocce su E. faecalis ATCC 29212 sono stati valutati calcolando la MIC e la MBC. La produzione dei radicali liberi dell’ossigeno e dell’azoto è stata valutata usando rispettivamente il sale fluorescente H2DCFDA e il saggio di Griess. La fagocitosi e il killing di E. faecalis sono stati valutati contando il numero di macrofagi infetti su vetrini colorati con Giemsa o contando il numero di CFUs dopo il saggio di protezione dell’antibiotico e le successive 24 ore di trattamento. La produzione di citochine infiammatorie e di fattori angiogenici è stata valutata con saggio ELISA. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in normossia e ipossia. Risultati: Le nanogocce non sono risultate tossiche fino alla concentrazione del 10% v/v, e sono state internalizzate sia dai macrofagi murini sia umani. Le nanogocce non hanno interferito con la crescita e la vitalità batterica. Le OLNDs hanno indotto i livelli di ROS e di NO nei BMDM, invece, i meccanismi di killing delle dTHP-1 non sono stati modificati. Dato l’incremento dei ROS e di NO, come atteso, il killing di E. faecalis da parte dei macrofagi murini è risultato essere migliorato dalle OLNDs e dalle OFNDs. Nessuna differenza è stata evidenziata tra nanogocce ossigenate e non ossigenate suggerendo che gli effetti erano probabilmente dovuti al guscio di destrano. Al contrario, il killing mediato dalle dTHP-1 non è stato modificato dalle nanogocce. Nella seconda parte del lavoro, l’effetto delle nanogocce sui mediatori dell’infiammazione e dell’angiogenesi è stato valutato nei sovranatanti delle dTHP-1 infette con E. faecalis. Le OLNDs e le OFNDs hanno mostrato un’attività antinfiammatoria riducendo le citochine pro-infiammatorie IL-1beta, IL-6 e TNFalfa in normossia e ipossia, di nuovo senza differenze tra i due carriers. Diversamente, come atteso, l’ipossia ha indotto il VEGF e solo le OLNDs hanno ripristinato un fenotipo simile alla normossia, confermando il rilascio di ossigeno. Conclusioni: In questo lavoro abbiamo ulteriormente confermato il potenziale delle OLNDs in qualità di tools innovativi per le ferite croniche evidenziando il loro ruolo duale nel migliorare il killing batterico e nel ridurre la risposta infiammatoria mediata dai macrofagi.