ANTHOCYANINS AND DOXORUBICIN-INDUCED CARDIOTOXICITY: AN INSIGHT INTO MOLECULAR MECHANISMS

Doxorubicin (Doxo) is one of the most used and effective chemotherapeutic drugs, however its use is limited by its severe side effects. The most feared one is cardiotoxicity, which can lead to cardiomyopathy and eventually heart failure. The search for a cardioprotective therapy is extremely important and the answer may come from natural compounds, easily accessible and with none downsides. Anthocyanins (ACNs) are a class of plant flavonoids, which have recently gained interest for their broad range of positive health effects. Our group previously demonstrated that an ACN-rich diet from purple corn was effective in counteracting Doxo-induced cardiotoxicity in mice. Starting from this study, my aim was to identify on which molecular pathway ACNs act to prevent Doxo side effects. The pathway I focused on is the FGF21-AMPKSIRT1- p53 axis. FGF21 emerged for its cardioprotective role once secreted from liver, adipose tissue or the heart. AMPK and SIRT1 are both involved in energy sensing and oxidative stress status. AMPK can induce SIRT1 activation increasing the NAD+/NADH ratio and once active SIRT1 can deacetylate several targets, including p53 at Lys379. My experiments were performed on HL-1, a murine cell line with an adult cardiomyocyte phenotype, and on mouse primary cardiomyocytes. Cells were treated with two different concentrations of Doxo in presence or absence of a purple corn extract, RED. Our results showed that RED inhibited the Doxo-induced excessive AMPK activation. This led to a decrease in the NAD+/NADH ratio, maintaining SIRT1 inactive. Since SIRT1 activity is reduced, p53 remained acetylated at Lys379, causing a decrease of apoptosis marker (Puma, p21 and cleaved-caspase 3). P53 remained acetylated also upon Sirt1 silencing, confirming their connection. Fgf21 silencing reduced the activation of AMPK and apoptosis markers. The hypothesis that the RED induced p53 acetylation is cardioprotective seems to be confirmed in mouse primary cardiomyocytes. In conclusion, RED may prevent cardiomyocytes apoptosis through modulation of AMPK activity and acetylation of p53.

La Doxorubicina (Doxo) è uno dei farmaci chemioterapici più usati ed efficaci, il cui utilizzo è limitato dalla sua cardiotossicità, che può indurre insufficienza cardiaca e, nei casi più gravi, infarto del miocardio. Attualmente le terapie cardioprotettive utilizzate comportano ulteriori effetti indesiderati ed è quindi di fondamentale importanza identificare farmaci o sostanze naturali in grado di ridurre la cardiotossicità della Doxo. I composti naturali possono essere un valido aiuto, in quanto privi di effetti indesiderati. Tra questi le antocianine, una classe di flavonoidi, presente in frutta e verdure rosso/viola possono rappresentare una possibile alternativa, in quanto numerosi studi ne hanno dimostrato il ruolo protettivo nei confronti di varie malattie del sistema cardiocircolatorio e nervoso, cancro e obesità. Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato come una dieta ricca di antocianine del mais rosso sia efficace nel prevenire la cardiotossicità indotta dalla Doxo in topi C57Bl/6J. A partire da questo studio, lo scopo del mio lavoro di dottorato è stato quello di identificare i meccanismi molecolari alla base della cardioprotezione mediata dalle antocianine. Mi sono concentrata sul pathway di FGF21-AMPK-SIRT1-p53. Questo pathway è coinvolto in diversi meccanismi di cardioprotezione. FGF21 viene secreto in risposta a diversi stress cardiaci. Sia AMPK sia SIRT1 vengono attivati in risposta a stress ossidativo e allo stato energetico della cellula. AMPK può attivare SIRT1, una deacetilasi NAD-dipendente, modulando il rapporto NAD/NADH. Uno dei target di SIRT1 è p53, che viene specificatamente deacetilato da SIRT1 alla Lisina379. I miei esperimenti sono stati svolti sui cardiomiociti HL-1, una linea cellulare murina con fenotipo da cardiomiociti adulti. Alcuni risultati sono stati poi confermati su cardiomiociti primari di topo. Le cellule sono state trattate con due dosi di Doxo in presenza o assenza di un estratto di mais rosso (RED). I risultati ottenuti indicano che la Doxo causa l’attivazione di AMPK, che di conseguenza causa un aumento del rapporto NAD+/NADH. Con questo rapporto elevato SIRT1 dovrebbe essere attivo, come viene confermato dal basso livello di acetilazione di p53 alla Lisina379. Quando p53 non è acetilato, si osserva un aumento dei marker apoptotici (Puma, p21 e caspasi-3) e della morte cellulare. In presenza dell’estratto RED, AMPK non risulta più attivo, il rapporto NAD+/NADH rimane basso e SIRT1 inattivo. Infatti, il livello di acetilazione di p53 alla Lisina379 è più elevato, causando una riduzione dei marker apoptotici e la sopravvivenza dei cardiomiociti. L’acetilazione di p53 alla Lisina379 sembra cruciale per la sopravvivenza dei cardiomiociti e questo dato sembra essere confermato nei cardiomiociti primari. In conclusione, l’effetto protettivo del RED sembra dovuto alla riduzione dell’attività di AMPK, che si traduce in una minore acetilazione di p53 (Lisina379), determinando la sopravvivenza dei cardiomiociti al trattamento con la Doxo.