STUDIO IN VIVO DEL RUOLO DEGLI iMSN NELLA CODIFICA DELL’ATTIVITÀ MOTORIA IN MODELLI MURINI MEDIANTE CALCIUM IMAGING

Striatum is the main input nucleus of the basal ganglia and 95% of its neurons are GABAergic Medium Spiny Neurons (MSNs). MSNs are subdivided into neurons of the direct and indirect pathway. The direct pathway consists of MSNs (direct MSNs, dMSNs) mainly expressing dopamine D1 receptors (D1R), whereas MSNs of the indirect pathway (iMSNs) express dopamine D2 receptor (D2R) and adenosine A2A receptor (A2AR) [Gerfen et al., 1990; Gerfen et al., 1992; Gong et al. 2003]. According to the classical model, these two pathways exert an opposite effect on movement regulation: the direct pathway promotes activity of the cortex that codes a motor plan, and therefore movement initiation, while the indirect pathway inhibits cortical activity and movement [Albin et al., 1989; Alexander and Crutcher, 1990; DeLong 1990]. Recent studies have challenged this interpretation and demonstrated that both pathways are co-activated during movement initiation but with differential activities [Bonnavion et al., 2019; Tecuapetla et al., 2016]. Yet, while the role of these two pathways is globally understood, cell-specific mechanisms and their interaction in relation to movement control are only partially known. Modern technological advances such as calcium (Ca2+) imaging techniques can be applied to directly observe the neuronal activity in these two pathways. During periods of heightened neural activity, Ca2+ flows into the dendritic branches and cell bodies of neurons, increasing its intracellular concentrations. These activity-dependent fluctuations in intracellular Ca2+ can be monitored by expressing a Ca2+ indicator, such as GCaMP, into the neuronal population of interest. The aim of this study was to investigate the role of murine striatum in locomotion, and in particular the involvement of iMSNs, using recent in vivo Ca2+ imaging technologies. Locomotor activity was tested by behavioural experiments and the GABAergic iMSN activity was stimulated by a psychostimulant drug, d-Amphetamine, at different doses. In this study, in vivo calcium imaging was used to visualize striatal neural circuit dynamics of the indirect pathway during mouse behaviour with head-mounted microscopes and chronically implanted endoscopes. A2AGCaMPs mice expressing GCaMP in iMSNs were used as an animal model. Behavioural analysis showed that acute intraperitoneal injection of d-Amphetamine at 3 mg/kg dose markedly increases locomotor activity with a peak 15 minutes after injection, while a dose of d-Amphetamine at 1 mg/kg modestly decreases locomotor activity, possibly due to the induction of stereotyped behaviour. Traces of iMSN calcium activity were extracted from the imaging data and analysed with custom developed software. The results showed a significant decrease in the average number of active iMSNs and a significant increase in the average spike duration after d-Amphetamine 3 mg/kg injection. At 1mg/kg dose, there was a trend for a significant decrease in the average number of active cells and a significant increase in the average spike duration. Analysis of the acquired datasets showed how iMSNs encode movement, confirming previous results reported by Parker and colleagues [Parker et al, 2018]. In detail, the analysis revealed that iMSN activity rises around 0.5-0.7 seconds before motion onset and falls around 1-0.5 seconds before motion offset, suggesting that increased firing of iMSNs encodes locomotion. However, it is not clear whether movement or rest are encoded by changes in the activity of randomly distributed iMSNs or specific sub-sets of iMSNs change their activity during rest or movement. This study allows us to better understand the complexity of MSN activity, challenging the classical view where the direct and indirect pathway show an opposite pattern of activity during movement.

Lo striato, il principale nucleo dei gangli della base, è costituito per il 95% da Medium Spiny Neurons (MSN) GABAergici. Gli MSN si suddividono in neuroni della via diretta e della via indiretta. Gli MSN della via diretta (dMSN), esprimono i recettori per la dopamina D1 (D1R), mentre gli MSNs della via indiretta (iMSN) esprimono i recettori dopaminergici D2 (D2R) e per l’adenosina A2A (A2AR) [Gerfen 1990; Gerfen 1992; Gong 2003]. Secondo l’interpretazione classica, queste due vie esercitano un effetto opposto nella regolazione dell’attività motoria: la via diretta promuove l’attivazione della corteccia coinvolta nella codifica dei piani motori, e di conseguenza promuove l’avvio del movimento, mentre la via indiretta inibisce l’attività corticale e il movimento [Albin 1989; Alexander and Crutcher, 1990; DeLong 1990]. Studi più recenti hanno modificato questa interpretazione e dimostrato che entrambe le vie risultano essere attive durante l’avvio del movimento, sebbene con alcune differenze [Bonnavion 2019; Tecuapetla 2016]. Ad oggi, mentre il ruolo di queste due vie è globalmente compreso, gli specifici meccanismi cellulari e la loro interazione in relazione al controllo motorio rimangono parzialmente sconosciuti. Tecnologie moderne, fra cui il calcium (Ca2+) imaging, possono essere applicate per meglio comprendere il coinvolgimento di queste due vie. Quando vi è un’intensa attività cellulare, il Ca2+ entra nelle diramazioni dendritiche e nei corpi cellulari, incrementando la concentrazione intracellulare. Queste fluttuazioni del Ca2+ possono essere monitorate mediante indicatori del Ca2+, come il GCaMP. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di investigare il ruolo dello striato nella locomozione murina, in particolare il coinvolgimento degli iMSN mediante tecnica di Ca2+ imaging in vivo. L’attività motoria è stata studiata mediante test comportamentali, mentre l’attività GABAergica degli iMSN è stata investigata dopo somministrazione di anfetamina, una sostanza psicostimolante, a diverse dosi. In questo studio, il circuito della via indiretta è stato visualizzato mediante calcium imaging in vivo attraverso un microscopio associato ad un endoscopio impiantato cronicamente. Come modelli murini sono stati utilizzati topi A2AGCaMP6S esprimenti GCaMP negli iMSN. L’analisi comportamentale ha rivelato che l’iniezione acuta intraperitoneale di anfetamina alla dose di 3 mg/kg incrementa significativamente la locomozione, con un picco a 15 min dopo l’iniezione, mentre la dose di 1 mg/kg riduce lievemente l’attività motoria, probabilmente a seguito dell’induzione di stereotipie. L’analisi dei transienti del calcio negli iMSN ha evidenziato una decrescita marcata del numero di iMSN attivi e un incremento della durata degli spike a seguito della somministrazione di anfetamina a 3 mg/Kg. La stessa tendenza è stata mantenuta a seguito dell’iniezione ad 1 mg/kg. Inoltre, comparando i dati ricavati dal Ca2+imaging e i dati comportamentali, è emerso come gli iMSN codifichino il movimento, confermando precedenti studi [Parker 2018]. L’analisi dimostra che l’attività degli iMSN aumenta circa 0,5-0,7 secondi prima dell’avvio del movimento e decresce circa 1-0,5 secondi prima dell’arresto del movimento. Tuttavia, non è ancora chiaro se il movimento o l’assenza di movimento siano codificati da cambiamenti di attività distribuiti casualmente nella popolazione di iMSN o se determinate sottopopolazioni di iMSN modifichino con regolarità la loro attività specificatamente durante uno dei due stati di attività motoria. Questo studio ha portato nuovi elementi interpretativi relativi alla complessità dell’attività degli iMSN, portando supporto all’ipotesi che sostiene la necessità di un’attivazione della via indiretta all’avvio del movimento.