La genomica su singola cellula rivela la gerarchia e l'architettura clonale nelle Neoplasie Mieloproliferative

Somatic mutations in Hematopoietic Stem Cells (HSCs) cause Myeloproliferative Neoplasms (MPNs), including Polycythemia Vera, Essential Thrombocythemia and Primary Myelofibrosis (PMF). PMF is a heterogeneous disorder consisting of bone marrow fibrosis, megakaryocyte hyperplasia and extramedullary hematopoiesis and is characterized by the worst prognosis among MPNs. About 15-20% of patients are unresponsive to conventional therapies and develop Acute Myeloid Leukemia (AML). In HSCs the main mutations, identified as “driver mutations” during MPNs pathogenesis, involve JAK2, CALR and MPL genes; in addition, many other genetic alterations contribute to the prognosis worsening and the development of AML. Disease progression and leukemic evolution in PMF results from an increase of the genomic complexity and clonal heterogeneity. Many studies confirmed that the mutational acquisition order affects the clinical outcome. However, the clonal architecture determining disease evolution and the clones guiding leukemic transformation are poorly understood. Recent studies demonstrate that single-cell (sc) genomics is a sensitive technique suitable to study clonal heterogeneity and to detect the evolution of the malignant cells in hematological neoplasms. For this reason, we used the sc-genomics approach to clarify the clonal complexity in PMF. Firstly, we developed a workflow for CD34+ Hematopoietic Stem Progenitor Cells (HSPCs) isolation from cord blood, fixation and immunostaining for CD34, in order to singularly separate the cells by DEP-array system (Menarini Silicon Biosystem) and to obtain a cell population suitable for sc-analysis. Then, we compared different whole genome amplification (WGA) protocols for single cells in order to obtain a uniform DNA amplification for Sanger sequencing and minimize allele drop out effect. Based on this method, we analyzed the CD34+ HSPCs of a PMF patient carrying JAK2V617F and other MPN frequent mutations. This patient was treated with JAK2-inhibitor Ruxolitinib but he was unresponsive to therapy and evolved to AML. In order to reconstruct the clonal hierarchy and architecture, we analyzed CD34+ cells during chronic phase (T1), the accelerated phase (T2) and the AML phase (T3). By means to sc-analysis, we established that TET2 was the first mutated gene, preceding JAK2 mutation, and this probably conferred a lower sensitivity to treatment. Moreover, we identified an increase of the allele burden of the TP53 mutation during disease progression, suggesting that TP53-mutated clones supported the accelerated (T2) phase. Interestingly, we already detected in T1 phase a small cell fraction, undetectable by bulk NGS and carrying the leukemogenic FLT3 mutation, probably driving the T3 phase. Finally, we characterized SRSF2 homozygous mutation that has not been described yet. Altogether our data demonstrate that sc-genomics is a promising method to uncover clonal heterogeneity in MPNs, highlighting the early occurrence of pro-leukemic mutations and to describe the real scenario of mutational events in hematological diseases.

Le Neoplasie Mieloproliferative (MPN) sono disordini ematologici caratterizzati dalla presenza di mutazioni somatiche che colpiscono le cellule staminali ematopoietiche e comprendono la Policitemia Vera, la Trombocitemia Essenziale e la Mielofibrosi Primaria (PMF). La PMF è una neoplasia eterogenea, contraddistinta dalla presenza di fibrosi midollare, iperplasia megacariocitaria e ematopoiesi extramidollare, e mostra la peggiore prognosi tra tutte le MPN. I pazienti spesso non rispondono ai trattamenti e nel 15-20% dei casi sviluppano una Leucemia Mieloide Acuta (LMA). Le mutazioni ricorrenti, conosciute come “mutazioni drivers”, interessano i geni JAK2, CALR e MPL, ma a complicare il profilo mutazionale intervengono altre alterazioni che sono spesso responsabili del peggioramento del quadro clinico e della trasformazione leucemica. La progressione della malattia e l’evoluzione leucemica nella PMF è accompagnata da un aumento della complessità genomica e dell’eterogeneità clonale. Molti studi hanno confermato come l’ordine di acquisizione delle mutazioni influenzi il decorso clinico. Tuttavia sono ancora poco conosciute le caratteristiche dei cloni che determinano la malattia e che guidano la trasformazione leucemica. Studi recenti hanno dimostrato come la genomica su singola cellula sia una tecnica sensibile per studiare l’eterogeneità clonale e l’evoluzione delle leucemie. Per questa ragione, abbiamo adottato un approccio di genomica su singola cellula per risolvere la complessità clonare della PMF. Dapprima abbiamo sviluppato un metodo di isolamento delle cellule staminali e progenitori ematopoietici CD34+ dal sangue cordonale, di fissazione e marcatura del CD34, al fine di ottenere una popolazione cellulare adatta alla separazione in singole cellule, sfruttando il sistema del DEP-array (Menarini Silicon Biosystem). In seguito, abbiamo confrontato diversi protocolli di amplificazione dell’intero genoma su singola cellula al fine di ottenere un’amplificazione omogenea, minimizzando l’effetto di allele drop out, per proseguire con il sequenziamento Sanger. Usando questa procedura, abbiamo analizzato le cellule CD34+ di un paziente affetto da PMF, positivo per la mutazione JAK2V617F e per altre alterazioni genetiche, caratteristiche delle MPN. Il paziente, nonostante il trattamento con il JAK2-inibitore Ruxolitinib, ha sviluppato una LMA. Al fine di ricostruire la gerarchia e l’architettura clonale, abbiamo analizzato le cellule CD34+ alla diagnosi (T1), durante la fase accelerata (T2) e nella fase di LMA (T3). Grazie alla analisi su singola cellula, abbiamo stabilito che il primo evento mutazionale investa TET2, precedendo la mutazione di JAK2, e probabilmente influenzando negativamente la risposta alla terapia. Abbiamo osservato, inoltre, un aumento dei cloni mutati per TP53 durante la progressione della malattia, suggerendo che siano stati questi cloni a supportare la fase T2. Inaspettatamente, già nella fase T1, abbiamo riscontrato una piccola popolazione cellulare recante una mutazione pro-leucemica su FLT3, alterazione che non era stata evidenziata dall'analisi in NGS ma che verosimilmente ha guidato lo sviluppo della fase T3. Infine, abbiamo evidenziato una mutazione omozigote su SRSF2 non ancora descritta. Tutti i nostri dati, confermano quindi come la genomica su singola cellula sia una tecnologia promettente di analisi della eterogeneità clonale delle MPN e che permetta sia di evidenziare precocemente caratteristiche leucemiche sia di ottenere un quadro chiaro degli eventi mutazioni che interessano i disordini ematologici.