Sviluppo di metodi alternativi al metodo biologico per la determinazione rapida delle biotossine marine nei molluschi bivalvi

Paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins are highly toxic compounds mainly produced by marine dinoflagellates belonging to Alexandrium, Gymnodinium and Pyrodinium genera. The phytoplanktonic toxins can be accumulated in filter feeding shellfish and other seafood. PSP toxins bind to voltage-gated sodium channels and prevent the flux of ions across the membrane. As a result, the toxins cause paralytic shellfish poisoning (e.g. neurological distress) in human. In the past the mouse bioassay (MBA) was method used for detecting PSP toxins in bivalve mollusks. According to Regulation (EU) 2021/1709, PSP toxins content of bivalve mollusks shall be determined using EN 14526:2017, Fluorescence Detection method using pre-column derivatization, by prohibiting any method entailing the use of a live animal. Alternative methods for analysis of PSP toxins were studied to obtain faster, quicker and easier method than official HPLC/FLD method. We tested spiked and naturally incurred samples for the optimization of both competitive in vitro assay on cell cultures and HPLC-HRMS method as screening method for the assessment of the presence of algal toxins. The results show the possibility of using LC-HRMS or assays based on the use of cell cultures (Cell Based Assays) as alternative methods to animal experiments to highlight the presence of PSP toxins.

Le tossine PSP (paralytic shellfish poison) sono composti altamente tossici prodotti principalmente da dinoflagellati marini appartenenti ai generi Alexandrium, Gymnodinium e Pyrodinium. Le tossine fitoplanctoniche possono essere accumulate nei molluschi filtratori e in altri frutti di mare. Le tossine PSP si legano ai canali del sodio e impediscono il flusso di ioni attraverso la membrana. Di conseguenza, le tossine causano sintomi di avvelenamento (ad esempio di natura neurologica) nell'uomo. In passato il test biologico sui topi (MBA) era un metodo utilizzato per rilevare le tossine PSP nei molluschi bivalvi. Secondo il regolamento (UE) 2021/1709, il contenuto di tossine PSP dei molluschi bivalvi deve essere determinato utilizzando la norma EN 14526:2017, metodo di rilevamento in fluorescenza mediante derivatizzazione pre-colonna, vietando qualsiasi metodo che implichi l'uso di un animale vivo. Sono stati studiati metodi alternativi per l'analisi delle tossine PSP per ottenere un metodo più rapido e semplice rispetto al metodo HPLC/FLD ufficiale. Abbiamo testato campioni fortificati e campioni naturalmente contaminate per l'ottimizzazione sia del test competitivo in vitro su colture cellulari che del metodo LC-HRMS come metodo di screening per la valutazione della presenza di tossine algali. I risultati mostrano la possibilità di utilizzare LC-HRMS e i saggi basati sull'utilizzo di colture cellulari (Cell Based Assays) come metodi alternativi alla sperimentazione animale per evidenziare la presenza di tossine PSP.