Transcription factor EB controls metabolic flexibility during exercise

Il muscolo scheletrico è il tessuto più abbondante dell’organismo e rappresenta più del 40% della massa corporea. Questo organo è responsabile del 30% della spesa energetica a riposo, suggerendo la sua importanza non solo a livello di locomozione ma anche nel controllo del metabolismo a livello sistemico. Infatti il muscolo scheletrico è un tessuto estremamente dinamico, capace di modulare il suo metabolismo in seguito a stimoli di diversa natura. Uno stimolo che attiva maggiori adattamenti metabolici è l’esercizio, che è noto attivare anche l’autofagia. L’esercizio fisico stimola molti effetti benefici sul contenuto e funzionalità mitocondriale, ossidazione degli acidi grassi e assorbimento del glucosio; tuttavia, è considerato uno stimolo che danneggia la normale omeostasi delle fibre muscolari per cui necessita di essere controbilanciato dall’attivazione di meccanismi trascrizionalmente controllati che contrastano gli stress meccanici e metabolici prodotti durante la contrazione. Il ruolo dei fattori di trascrizione FoxO e TFEB nel regolare la degradazione proteica e l’autofagia è largamente conosciuto. Tuttavia, il ruolo di TFEB nel muscolo scheletrico e i suoi possibili effetti nel regolare gli adattamenti derivanti dall’esercizio in questo tessuto non sono ancora chiari. TFEB è stato proposto come fattore chiave nel coordinare autofagia e biogenesi lisosomiale in cellule in coltura, con diverse evidenze che dimostrano la regolazione della sua attività. In particolare è noto come la fosforilazione operata da mTORC1 sia in grado di prevenire l’attivazione di TFEB sequestrandolo nel citoplasma. Tuttavia, non esistono dati riguardanti le possibili fosfatasi coinvolte nell’attivazione di TFEB. Mediante l’utilizzo di uno High Content Screening in grado di monitorare la traslocazione di TFEB nel nucleo durante la starvation, abbiamo identificato il gene PPP3CB, codificante la subunità catalitica della calcineurina, come uno dei migliori geni coinvolti nella rilocalizzazione di TFEB. Abbiamo dimostrato che l’attività della calcineurina è necessaria e sufficiente per spingere TFEB nel nucleo, dove può espletare la sua funzione. Tuttavia, la calcineurina è noto essere attiva nel muscolo scheletrico durante la contrazione come conseguenza dei transienti di calcio. Per questo motivo ci siamo chiesti se l’attività della calcineurina possa influenzare la traslocazione di TFEB nel nucleo anche nel muscolo scheletrico durante l’esercizio fisico. Utilizzando un reporter TFEB-GFP abbiamo dimostrato che l’attività della calcineurina è necessaria e sufficiente a promuovere la traslocazione nucleare di TFEB anche nel muscolo scheletrico durante la contrazione. Tuttavia il significato fisiologico di questo avvenimento rimane da essere spiegato. Per rispondere a questa domanda abbiamo usato degli approcci di gain e loss of function utilizzando infezioni virali con vettori per l’overespressione di TFEB, una linea di topi con delezione muscolo specifica di TFEB e un’altra linea in cui l’overespressione di TFEB può essere attivata in muscolo grazie al tamoxifen. Da uno studio di espressione genica in muscoli overesprimenti TFEB e TFEB deficienti, abbiamo trovato che le vie di segnale principalmente coinvolte dalle manipolazioni genetiche erano quelle correlate alla biogenesi mitocondriale, utilizzo dei lipidi e omeostasi del glucosio. Abbiamo perciò cominciato a dissezionare il ruolo di TFEB nel muscolo scheletrico provando che la sua attivazione è richiesta per la biogenesi mitocondriale, che è per l'appunto aumentata nei muscoli transgenici. Infatti, in questi abbiamo trovato un aumento nel numero e nella dimensione dei mitocondri, mentre abbiamo riportato solo una piccola percentuale di mitocondri disfunzionali nei muscoli knockout. Questi cambiamenti sono accompagnati da un’attivazione dei geni TFEB-dipendenti responsabili per la biogenesi e funzionalità mitocondriale. Inoltre, questi cambiamenti morfometrici e di espressione genica correlano con un aumento nella respirazione mitocondriale e nell’attività dei complessi della catena respiratoria. Per questo motivo i muscoli transgenici producono più ATP dei wildtype, mentre i muscoli KO presentano una ridotta sintesi di ATP a causa di una disfunzionalità della membrana mitocondriale che dissipa il gradiente protonico. Tuttavia, per capire se questi cambiamenti dipendono direttamente da TFEB indipendentemente da PGC1α, abbiamo monitorato l’espressione di NRF1/2, TFAM e altri geni coinvolti nella biogenesi mitocondriale in un modello in cui PGC1α è deleto e TFEB overespresso. Questi dati di espressione uniti alle misure delle attività dei complessi dimostrano che TFEB è in grado di indurre autonomamente la biogenesi mitocondriale legandosi direttamente ai promotori dei geni NRF1 e NRF2. A questo punto abbiamo sottoposto a esercizio i topi riscontrando che gli animali transgenici resistono maggiormente all’attività fisica; al contrario i topi KO presentano una marcata intolleranza all’esercizio a causa della scarsa produzione di ATP. Per spiegare meglio questo fenomeno, grazie a misurazioni di parametri metabolici abbiamo riscontrato che i topi KO fanno affidamento maggiormente nell’ossidazione del glucosio sia a riposo che durante le fasi iniziali dell’esercizio fisico, spiegando l’intolleranza con la fine delle riserve di glicogeno. Inoltre, le quantificazioni del lattato nel siero prima e dopo l’esercizio suggeriscono che i muscoli KO dipendono maggiormente dalla glicolisi anaerobia a differenza delle controparti wildtype e transgenica. A questo punto, per investigare più in dettaglio il ruolo dell’ossidazione del glucosio che sembra essere alla base dell’intolleranza all’esercizio, abbiamo misurato i livelli di glucosio intramuscolare negli animali KO, notando che a riposo questi presentano una riduzione considerevole delle riserve. Per questo motivo gli animali KO, dopo i primi momenti di esercizio, sono costretti a cambiare il loro metabolismo verso una maggiore ossidazione degli acidi grassi che comunque non riesce a supportare la domanda energetica a causa dei mitocondri disfunzionali. Tutte queste evidenze indicano che TFEB controlla più il metabolismo rispetto all’autofagia la quale non è influenzata dalla modulazione genetica di TFEB; più in dettaglio TFEB sembra controllare direttamente il metabolismo del glucosio che è alterato negli animali TFEB-deficienti. Un ridotto assorbimento del glucosio e una ridotta sintesi del glicogeno durante gli EU-clamps spiegano perché le riserve di glicogeno sono ridotte negli animali KO mentre la controparte transgenica ne accumula in più. Questi effetti fenotipici sono accompagnati da un cambiamento nell’espressione di geni connessi all’omeostasi del glucosio, con maggiore presenza di trascritti per i trasportatori di glucosio and regolatori della sintesi del glicogeno nei muscoli transgenici, anche in assenza di PGC1α. Inoltre, l’overespressione di TFEB è in grado di modulare anche l’attività di nNOS e AMPK, influenzando l’omeostasi del glucosio non solo dal punto di visto trascrizionale, ma impattando anche sulle vie di segnale ad esso correlate. In conclusione tutte queste scoperte sostengono fortemente una nuova visione di TFEB come un fattore chiave nella regolazione della flessibilità metabolica durante l’esercizio fisico in modo indipendente da PGC1α.