SEX-DEPENDENT PROPERTIES OF HUMAN ENDOTHELIAL CELLS: FOCUS ON ENOS

Atherosclerosis and cardiovascular disease (CVD) are classical examples of diseases where sex/gender differences have been described. A significant body of evidence suggests that CVD is less prevalent in women than men until midlife, and the female advantage has been attributed to estrogens, which are lost with menopause. The earliest event in the onset of atherosclerosis and CVD is endothelial dysfunction (ED). For this reason, many in vitro studies have been performed in endothelial cells (ECs). However, the sex of ECs has not been consistently reported. Therefore, we thought of interest to compare the behavioral and molecular features of human primary male and female ECs obtained from umbilical cords (HUVECs, abbreviated as M-ECs and F-ECs, respectively) . To study the involvement of estrogens in the sex-related properties of ECs, we started by culturing HUVECs in a nominally hormone-free medium supplemented with charcoal-stripped serum (CS-FBS) commonly used for in vitro studies on hormone activities. Surprisingly, we found that both M-ECs and F-ECs underwent a significant decrease in cell number which was not reverted when sex hormones were added back to the culture medium. In addition, the presence of CS-FBS abrogated the ability of M-ECs and F-ECs to sprout in an in vitro 3-D angiogenesis assay. Since the inhibitory effect of CS-FBS was fully reverted by the re-addition of normal FBS, we focused our attention on fatty acids (FAs), that are lost in CS-FBS and that are crucially involved through their oxidation in the control of EC behavior. Reconstitution experiments performed by re-adding the acetyl-CoA precursor acetate or palmitic acid partially prevented the CS-FBS-induced inhibition of EC growth and sprouting. Therefore, a lack of FAs seems to be partly responsible for the impairment in the in vitro proliferative and angiogenic properties of M-ECs and F-ECs cultured in CS-FBS containing media. A reduced activity of eNOS plays a key role in CVD onset and development through the reduced formation of nitric oxide (NO) in ED. Therefore, we focused on the expression and the role of the enzyme in M-ECs and F-ECs. Interestingly, we found that F-ECs constitutively expressed an higher amount of eNOS both at mRNA and protein levels. Moreover, F-ECs possessed greater migratory capabilities in comparison to M-ECs. Importantly, the increased female migratory properties were counteracted by the treatment with the eNOS inhibitor L-NAME or by the silencing of the enzyme. At variance, M-EC motility was independent of eNOS activity. Since angiogenesis is the result of a coordinated process where the migration of specialized cells – the tip cells – and the proliferation of the so-called stalk cells both contribute to the growth of new vessels, we evaluated in an in vitro 3-D spheroid assay the relative contribute of motility and proliferation to the M-EC and F-EC sprouting process. Notably, F-ECs confirmed their strictly dependence on migration and eNOS activity, whereas M-ECs showed a more important reliance on proliferation which was eNOS-independent. The different migratory behavior between M-ECs and F-ECs was confirmed in mixed spheroids from GFP-carrying M-ECs and Cherry Red-expressing F-ECs where the analysis of sprouts showed that F-ECs were located as tip cells in most of the sprouts. In conclusions, our results show that F-ECs have a higher migratory phenotype in comparison to M-ECs and are strictly dependent on eNOS activity for their migration and sprouting. The constitutive higher expression of eNOS in F-ECs, and the crucial requirement of its activity for motility and in vitro angiogenesis, might contribute to the protection against CVD characteristic of the younger female population, and might propose the development of novel sex-oriented strategies for the prevention and therapy of CVD.

Nonostante le malattie cardiovascolari siano percepite come malattie in prevalenza maschili, numerosi dati clinici ed epidemiologici dimostrano che riguardano anche le donne. Quello che differenzia i due generi è che nelle donne si presentano con un ritardo di almeno 10 anni rispetto agli uomini in quanto si ritiene che le donne siano protette, perlomeno fino alla menopausa, dagli estrogeni. La solidità dei dati clinici ed epidemiologici non si associa però a un’altrettanto approfondita conoscenza dei meccanismi biologici e molecolari che stanno alla base di queste differenze. Va ricordato che nella complessa serie di eventi che sfocia nell’aterosclerosi e nella malattia cardiovascolare, il primo passaggio è rappresentato da una perdita di funzionalità dell’endotelio, la cosiddetta disfunzione endoteliale. Poiché molto poco si conosce sulle proprietà innate di cellule endoteliali (EC) maschili e femminili ci è parso particolarmente interessante indagare le caratteristiche di EC umane in coltura primaria derivate da cordoni ombelicali di donatori di sesso maschile o femminile (HUVECs, abbreviate rispettivamente in M-EC e F-EC). Nostro primo obiettivo è stato lo studio dell’influenza degli estrogeni sulle proprietà delle M-EC e F-EC. A tale scopo, abbiamo utilizzato un terreno di coltura privo di ormoni contenente siero fetale bovino sottoposto a procedura di stripping (CS-FBS). In queste condizioni, sia le M-EC che le F-EC hanno mostrato una riduzione della crescita e delle proprietà angiogeniche in vitro che la riaggiunta degli ormoni sessuali nel mezzo di coltura non è stata in grado di prevenire. Poiché l’effetto inibitorio di CS-FBS è revertito dall’aggiunta di FBS normale al terreno di coltura, ci siamo focalizzati sugli acidi grassi (FA) per due ragioni: i) non sono presenti nel CS-FBS; ii) la loro ossidazione è necessaria per la crescita delle EC e per l’angiogenesi. Infatti, l’aggiunta di acetato, un donatore di acetil-CoA, o di acido palmitico è stata in grado di revertire significativamente in entrambi i sessi l’inibizione della crescita e dello sprouting indotta da CS-FBS. Questi risultati confermano il ruolo centrale degli FA nella fisiologia delle EC sia maschili che femminili, e suggeriscono cautela nell’utilizzo di terreni contenenti CS-FBS per lo studio delle EC. In una successiva serie di esperimenti, abbiamo rivolto la nostra attenzione all’espressione e all’attività di eNOS in M-EC e F-EC, considerato il ruolo cruciale dell’enzima e del suo prodotto NO nella fisiologia dell’endotelio. Abbiamo innanzitutto osservato che le F-EC esprimono costitutivamente una maggiore quantità di eNOS, a livello sia di mRNA che di proteina, rispetto alle M-EC. Alla ricerca del significato biologico di questa differenza, abbiamo osservato che le F-EC hanno maggiori capacità migratorie rispetto alle M-EC, e soprattutto che la motilità di F-EC e M-EC differisce in maniera significativa nella dipendenza da eNOS. La migrazione delle F-EC è infatti ridotta dal silenziamento e dall’inibizione farmacologica di eNOS, che lasciano invece pressoché invariata la capacità migratoria delle M-EC. Abbiamo poi paragonato il contributo di migrazione e proliferazione al processo di sprouting delle M-EC e F-EC in un saggio 3-D di angiogenesi in vitro in cui è stata confermata la stretta dipendenza delle F-EC dall’attività di eNOS e dalla migrazione. Al contrario, le M-EC mostrano una stringente dipendenza dalla proliferazione che non coinvolge l’attività di eNOS. In conclusione, a differenza delle M-EC, le F-EC sembrano essere strettamente dipendenti dall’attività di eNOS per la migrazione e lo sprouting. La maggiore espressione costitutiva di eNOS nelle F-EC potrebbe contribuire alla protezione contro le malattie cardiovascolari che caratterizza la popolazione femminile prima della menopausa, e suggerire lo sviluppo di nuove strategie sex-oriented per la prevenzione e la terapia delle malattie cardiovascolari.